Michael S. Young、Kim van Tran、Evelyn Goh和Jeremy C. Shia 

沃特世公司(美國馬薩諸塞州米爾福德)

■從乳品或肉類中快速萃取氨基糖苷類抗生素

■快速LC/MS/MS分析

■直接固相萃取(SPE)凈化

■低ppb檢測限值

ACQUITY UPLC^® 系統(tǒng)

ACQUITY^® TQD 質(zhì)譜儀

ACQUITY UPLC HSS PFP 色譜柱

Oasis^® HLB 萃取柱

聚丙烯樣品瓶

氨基糖苷類抗生素會作為獸藥被用于治療產(chǎn)肉和產(chǎn)乳動物，因此需要一種分析其在這些商品中殘留的有效分析方法。這類抗生素給殘留分析提出了巨大的挑戰(zhàn)。與其他大多數(shù)抗生素不同，這些化合物無法使用乙腈或其他有機(jī)溶劑從組織或乳品中萃取出來。在研究中，使用含有三氯乙酸(TCA)的水性緩沖液將氨基糖苷類抗生素從肉類組織或乳品中萃取出來。加入TCA能夠使蛋白質(zhì)沉淀并抑制蛋白與這些分析物結(jié)合。進(jìn)行LC/MS分析前，利用有效的固相萃取(SPE)凈化操作除去殘留的TCA，盡量減少共萃取干擾。通過使用Oasis HLB(高效、水可浸潤性反相吸收劑)，在牛奶和肉中可獲得良好的固相萃取收率和凈化效果。在隨后的分析中，使用ACQUITY UPLC HSS PFP色譜柱，在反相離子對模式下，可獲得出色的UPLC^®分離性能。七氟丁酸(HFBA)用作離子配對試劑。該試劑具有揮發(fā)性且能與質(zhì)譜法結(jié)合使用。

在全球范圍內(nèi)，氨基糖苷類抗生素在乳品中的最大殘留限量(MRL)一般范圍是100 ~ 1000 µg/kg，如圖1所示。本應(yīng)用紀(jì)要提供了一種適用于測定牛奶和牛組織中氨基糖苷類抗生素殘留在ppb水平的方法，該方法一部分是由參考文獻(xiàn)1和參考文獻(xiàn)2中的方法發(fā)展而來。

UPLC條件

色譜柱：   ACQUITY HSS PFP 2.1 x 100 mm，1.8 µm 部件號186005967                                                

溫度：     35°C              

流動相A：  20 mM HFBA水溶液 

流動相B：  20 mM HFBA乙腈溶液 

流速：     0.50 mL/min               

梯度：     20% B初始條件，7分鐘內(nèi)線性梯度增至80% B，保持8分鐘，濃度降回至20% B，持續(xù)8.1分鐘。重新平衡，保持10分鐘。                 

模式：     正離子電噴霧(ESI+)               

碰撞氣體：     氬氣，流速0.20 mL/min

表1匯總了本研究中使用的錐孔和碰撞參數(shù)和多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)轉(zhuǎn)換。 

樣品制備

將0.77 g乙酸銨(NH4OOCH3)置于1L的容量瓶中。加入大約900 mL試劑水，溶解。使用1 N HCl或1 N NaOH將pH值調(diào)節(jié)至4.0。加入0.15 g乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA.2H2O)、5 g氯化鈉(NaCl)和20 g三氟乙酸(TCA)。充分混合，使固體溶解，加試劑水至刻度。

初步萃取：

將2 g均勻的牛組織或10 mL牛奶置于50 mL離心管中。加入20 mL萃取緩沖液，渦旋10秒鐘，然后充分震搖1分鐘。將樣品在4000 RPM下離心5分鐘，收集上清液。按需要使用稀HCl或NaOH將上清液pH調(diào)節(jié)至6.5±0.5。

SPE凈化：

本研究使用Oasis HLB 96孔板(30 mg)。如有需要，可使用一根1 cc/30 mg的萃取柱。先后使用1.5 mL甲醇、1.5 mL水,平衡板孔或萃取柱。將流速設(shè)置為1 mL/min或更低。加入初步萃取得到的pH值調(diào)節(jié)后的上清液，對于組織樣品，加入1 mL上清液，對于乳品樣品，加入1.5 mL上清液。以1 mL水清洗。用0.5 mL 10:5:85的甲酸/異丙醇/水洗脫。加入1.5µL HFBA，使用UPLC/MS/MS進(jìn)行分析。

結(jié)果與討論

圖2是由加標(biāo)牛奶樣品得到的重現(xiàn)的UPLC/MS/MS圖譜。相同的條件也可用于牛肉樣品的分析。

以同份異構(gòu)體形式出現(xiàn)并得到部分分離。對這些樣品的峰面積進(jìn)行加和，以便進(jìn)行定量分析。

回收率的測定方法是將樣品制備前加到樣品基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)品的MRM峰面積與在所有樣品制備步驟完成后加到樣品基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積進(jìn)行對比。

肉類的基質(zhì)效應(yīng)低于30%，乳品的基質(zhì)效應(yīng)低于12%。與其他被使用的諸多抗生素獸藥不同，氨基糖苷類抗生素不能使用有機(jī)溶劑從動物組織和相關(guān)樣品中萃取出來。但是，這些化合物可以使用水性緩沖液有效地從組織中萃取出來。該萃取緩沖液包括促進(jìn)蛋白質(zhì)沉淀的試劑(TCA)。

Oasis HLB固相萃取方法使用有機(jī)溶劑含量低的洗脫液，與其他甲醇型洗脫液相比(使用甲酸/甲醇洗脫的基質(zhì)效應(yīng)大于50%)可使凈化效果得以提高。很明顯，使用水性洗脫液洗脫氨基糖苷類后，吸附劑上能保留大量的基質(zhì)干擾成分。

選用離子對反相色譜模式UPLC分析。通過使用20 mM七氟丁酸作為離子對試劑實(shí)現(xiàn)峰形和靈敏度最佳平衡。也考慮了使用親水性相互作用色譜的UPLC分析，但是，峰形并不如所選方法得到的峰形尖銳。另外，親水性相互作用色譜模式的缺點(diǎn)是標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的稀釋劑應(yīng)當(dāng)為乙腈。本應(yīng)用紀(jì)要中提供的優(yōu)化的固相萃取法提供水性樣品進(jìn)樣，更適于反相色譜分析。

結(jié)論

■使用針對離子對反相色譜的ACQUITY UPLC HSS PFP分析色譜柱可獲得出色的UPLC性能。

■七氟丁酸(HFBA)是一種用于UPLC分析的有效離子對試劑。

■提出了從牛肉和牛奶中萃取氨基糖苷類抗生素的簡便程序；一個操作人員每天即可輕松分析20個樣品。

■提出了使用Oasis HLB 96孔板的優(yōu)化的固相萃取方法。牛奶樣品分析的檢測限為10 ppb，牛肉樣品分析檢測限是50 ppb；對于在該水平的所有分析物，分析信噪比大于100:1。

1.  Screening and Confirmation for Aminoglycosides by UHPLC-MS-MS  

(United States Department of Gariculture Food Safety and Inspection Service, 

Office of Public Health Science).

2.  Plozza T, Trenerry VC, Zeglinski P, Nguyen H, Johnstone P. The Confirmation and Quantification of Selected Aminoglycoside Residues in Animal Tissue 

and Bovine Milk by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry. 

International Food and Research Journal. 2011; 18(3): 1077-1084.