1、掌握2．6-二氯酚靛酚測定維生素C的原理和方法。

    二、原理：

    還原型抗壞血酸能還原染料2.6-二氯酚靛酚，該染料在酸性中呈紅色，被還原后紅色消失。還原型抗壞血酸還原2.6-二氯酚靛酚后，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。在沒有雜質干擾時，一定量的樣品提取液還原標準2.6-二氯酚靛酚的量與樣品中所含維生素C的量成正比。

    反應式如下：

還原型抗壞血酸染料(粉紅色)脫氫型抗壞血酸染料(無色)

    三、試劑：

    (1)2％草酸溶液：溶解20克草酸結晶于200毫升水中，然后稀釋至1000ml。

    (2)1％草酸溶液：取上述2％草酸溶液500ml，用水稀釋至1000m1。

    (3)抗壞血酸標準溶液：準確稱取20mg抗壞血酸，溶于1％草酸溶液中，移入lOml量瓶中，并用1％草酸溶液稀釋至100毫升，混勻，置冰箱中保存。

    使用時吸取上述抗壞血酸5ml，置于50毫升容量瓶中，用1％草酸溶液定容之。此標準使用液每毫升含0.02mg維生素C。

    標定：吸取標準使用液5m1于三角燒瓶中，加入6％碘化鉀溶液0.5ml，1％淀粉溶液3滴，再以0.001N碘酸鉀標準溶液滴定，終點為淡藍色。

計算如下：

        抗壞血酸濃度（mg/ml）=( V1×0.088)/V2

V₁：滴定時所耗0.001N碘酸鉀標準溶液的量(ml)

V₂：所取抗壞血酸的量(ml)

0.088：lml O.0001N碘酸鉀標準溶液相當于抗壞血酸的量(mg／m1)

    (4)2.6：二氯靛酚溶液：稱取碳酸氫鈉52mg，溶于200ml沸水中，然后稱取2.6-二氯靛酚50mg，溶解在上述碳酸氫鈉的溶液中，待冷，置于冰箱中過夜，次日過濾置于250ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。此液應貯于棕色瓶中并冷藏，每星期至少標定1次。

標定方法：取5m1已知濃度的抗壞血酸標準溶液，加入1％草酸溶液5ml，搖勻，用上述配制的染料溶液滴定至溶液呈粉紅色于15秒不褪色為止

每毫升染料溶液相當于Vc的毫克數=滴定度(T)=(C×V₁)/V2

式中：

    C；抗壞血酸(V)的濃度(mg／m1)

    V_l：抗壞血酸的量(m1)

    V₂：消耗染料溶液量(m1)

    (5)0.1N碘酸鉀溶液：精確取干燥的碘酸鉀0.100ml。0.3567克用水稀釋至100ml.

    (6)0.001N碘酸鉀溶液：吸取0.1N碘酸鉀溶液1ml，用水稀釋至100毫升。此溶液1ml相當于抗壞血酸0.088mg。

    (7)1％淀粉溶液。

    (8)6％碘化鉀溶液。

     四、操作方法：

    1、稱取適量(50.0-100.0克)樣品，加等量的2％草酸溶液，倒入組織搗碎機中搗成勻漿。稱取10.00-30.00克漿狀樣品(使其含有抗壞血酸1-5mg)，置于小燒杯中，用1％草酸溶液將樣品移入100毫升容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻。

2、將樣液過濾，棄去最初毫升濾液。若樣液具有顏色，用白陶土(應選擇脫色力強但對抗壞血酸無損失的白陶土)去色，然后迅速吸取5-lOml濾液，置于50ml三角燒瓶中，用標定的2.6-二氯靛酚染料溶液滴定之,直至溶液呈粉紅色于15秒內不褪色為止。

   計算：                       

每百克樣品中抗壞血酸毫克數＝(V .T)/W×100

V：滴定時所耗去染料溶液的量(ml)；

    T：lml染料溶液相當于抗壞血酸標準溶液的量(mg)

    W：滴定時所取的濾液中含樣品量(g)．

    五、說明：

    (1)所有試劑配制最好用重蒸餾水。

    (2)樣品取樣后，應浸泡在已知量2％草酸溶液中使抗壞血酸受損失。以免發生氧化，使抗壞血酸受損失。

    (3)對動性的樣品可用10％三氯醋酸代替2％草酸溶液提取；對含有大量Fe的樣品，如儲藏過久的罐頭食品可用8％醋酸溶液代替草酸溶液提取。

    (4)整個操作過程要迅速，防止還原型抗壞血酸被氧化。

    (5)若樣品濾液無色，可不加色陶土。須加白陶土的，要對每批新的白陶土測定回收率。加白陶土脫色過濾后，樣品要迅速滴定。

    (6)滴定開始時，染料溶液要迅速加入，直至紅色不立即消失而后盡可能一滴一滴地加入，并要不斷振動三角燒瓶，直至呈粉紅色于15秒內不消失為止。樣品中可能有其他雜質也能還原2.6-二氯靛酚，但一般雜質還原該染料的速度均較抗壞血酸慢，所以滴定時以15秒鐘紅色不褪為終點。

    (7)測定樣品溶液時必須同時作一空白對照，樣品溶液滴定的毫升數須扣除空白液滴定的毫升數。

實驗法(二)    2.4-二硝基苯肼法

 一、原理：

    用酸處理過的活性炭把還原型的抗壞血酸氧化為脫氫型抗壞血酸再繼續氧化為二酮古樂糖酸。二酮古樂糖酸與2.4-二硝基苯肼偶聯生成紅色的絡合物。其呈色的強度與二酮古樂糖酸濃度成正比，可以比色定量。

二、試劑：

(1) 1％草酸溶液。

(2) 2％草酸溶液。

    (3) 酸處理過的活性炭：取200克活性炭，加入10％鹽酸1000ml，煮沸后，抽氣過濾，再用沸水1000ml煮沸，過濾，重復用水洗至濾液中無高價鐵離子(即用1％硫氰化鉀溶液試驗不呈紅色為止)，于100-120℃烘干。

    (4) 2％2.4-二硝基苯肼溶液：取2克2.4-二硝基苯肼溶液溶解于lOOml9N硫酸中。

    (5) 9N硫酸溶液：量取濃硫酸250ml，慢慢地倒入750m1水中，加水邊攪拌。

(6) 10％硫酸溶液：稱取5克硫酸，溶解于50ml50％酒精中。

(7) 85％硫酸溶液：精確稱取20mg抗壞血酸，溶解在1％草酸中，溶液稀釋至lOOml。吸取此液50ml，加入0.1克活性炭，振搖1分鐘，過濾吸取上述濾液5ml，用1％草酸稀釋到100毫升(此標準使用液每亳升含lOug抗壞血酸)。

    三、操作方法：

    (1)樣品的處理和分析：稱取適量樣品加等量的2％草酸溶液于組織搗碎機中打成勻漿。取勻漿20克用1％草酸稀釋至lOOml，搖勻，過濾。

    取濾液lOml，加入1％草酸10ml(取濾液的量視抗壞血酸含量而定，一般控制每毫升抗壞血酸的濃度為1-lOug)，加l勺活性炭，搖1分鐘，靜置過濾。

    各取濾液2毫升于樣品管和樣品空白管中，各管加1滴硫酸溶液。于樣品管中加入2.4-二硝基苯肼0.5ml，樣品管，樣品空白管加蓋，置于37℃保溫箱中保溫3小時。后取出樣品管放人冰水中，樣品管和樣品空白管置于冰浴中，從滴點管中滴加85％硫酸2ml于各管中，邊滴邊搖試管(為防止溶液溫度升高，溶液中糖炭化而轉黑色)。

    將各管于冰浴中取出，在室溫下放置30分鐘后，立即在分光光度計波長540nm處讀取光密度。根據測得的光密度，從標準曲線中查出相應的含量。

    (2) 標準曲線的繪制：分別吸取抗壞血酸標準工作液10、20、30、40、50ml，稀釋至50ml，這些標準液每毫升含有2、4、6、8、lOug抗壞血酸。   

    各取2ml，置于各標準管中，加硫酸溶液1滴和2．4-二硝基苯肼溶液0.5ml，置各管于30℃保溫箱中保溫3—4小時，取出，放在冰浴中，于各管中滴加85％硫酸2.5ml邊滴邊搖試管，然后取出，放置30分鐘，于分光光度計540nm波長條件下測定光密度。根據測得的光密度繪制標準曲線。

    同時作一試劑空白，于一試劑空白管中加入1％草酸溶液2m1，操作同標準管。

計算：每百克食品中含抗壞血酸的毫克數＝C/W×100

C：相當于標準溶液的量(mg)

W：測定時所取得樣品溶液相當于樣品的量(g)

四、說明：

(1)    加入85％硫酸后，將試管從水中取出。溶液的顏色會繼續變深所以必須計算好，加入硫酸后準于30分鐘內比色。

    (2)硫酸可防止抗壞血酸被氧化，且可幫助準于的形成，最終溶液中硫酸的濃度均需一致，否則影響色度。