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原理
向樣品中加入濃硫酸和催化劑，充分混勻，然后加熱消化分解，樣中碳和氫被氧化成二氧化碳和水，其中的有機氮轉化為硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數，即為蛋白質的含量。
樣品消化
濃硫酸具有脫水性和氧化性，可使有機物中的碳、氫被氧化為二氧化碳和水，蛋白質會分解為氨，然后氨與硫酸結合生成硫酸銨。通常加入硫酸鉀和硫酸銅作為催化劑來加快蛋白質分解。硫酸鉀可以提高溶液的沸點，一般情況下，純硫酸的沸點在340℃左右，但是在添加硫酸鉀后，可提高至400℃以上。提高溫度使有機物加快分解。但是不能加入過多的硫酸鉀，否則會因為溫度過高，使生成的硫酸銨發生熱分解成氨而造成損失。硫酸銅除作為催化劑外，還可以指示消化終點的到達，有機物全部消化完全后，溶液呈現清澈的藍綠色，硫酸銅還可以做蒸餾時堿性反應的指示劑。
蒸餾
消化液中的硫酸銨在堿性環境下會轉化成氨。為防止水中微量的氨氣受熱逸出，影響測定結果，所以水蒸氣發生器中的水要保持酸性。硫酸銨是一種強酸弱堿鹽，需要足夠的堿液使結合態的氨完全反應并釋放出來，這個過程中的氫氧化鈉一定要過量，過量的氫氧化鈉會與硫酸銅生成藍色的氫氧化銅沉淀，氫氧化銅受熱分解成黑色的氧化銅沉淀。檢驗蒸餾是否完成，可用奈氏試紙法，NH4+或NH3遇奈氏試劑會反應生成棕紅色的碘化汞銨化合物。
加熱蒸餾放出的氨可用硼酸溶液吸收，硼酸有吸收氨的作用，又因其呈微弱酸性，不影響下一步滴定時指示劑的變色反應。溫度過高會使硼酸吸收液對氨的吸收作用減弱，從而造成損失，故一般不超過40 ℃。
滴定
待吸收完全后，用硫酸或者鹽酸標準溶液進行酸堿滴定，滴定液的濃度直接影響結果的準確性，必須按照要求進行配制和標定。混合指示劑在中性溶液中呈灰色，滴定終點時液體呈灰色。
①所用的試劑溶液應用無氨蒸餾水配制；
②取樣應具有代表性,取樣前將樣品充分混勻；
③樣品稱量放入凱氏燒瓶時，切勿使樣品粘附在瓶頸部，避免樣品未消化完全而造成氮損失；
④為了保證使燒瓶壁上的殘渣消化完全，在消化過程中要不時地轉動凱氏燒瓶；
⑤消化脂肪或糖含量較高的樣品時，易產生大量泡沫，為防止泡沫溢出，消化時應先消化加熱并不斷搖動，或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑；
⑥當樣品消化液渾濁或未澄清透明時，可先將凱氏燒瓶放冷至室溫后，再加入30%的過氧化氫，然后繼續加熱消化；
⑦加堿后，漏斗要進行水封，避免因裝置漏氣造成氨的逸出影響結果的準確性；
⑧要保證蒸餾裝置不能漏氣；
⑨在蒸餾時反應室與外界存在的壓力差，蒸汽可將氨帶出。故蒸餾時，要保證蒸汽均勻、充足，中間不能停止加熱，防止發生倒吸；
⑩蒸餾前如果加堿后消化液呈藍色而沒有生成氫氧化銅沉淀，說明加入的堿量不足，需要適量補加堿；,蒸餾時為防止水蒸氣發生器內液體爆沸，加入幾片碎瓷片或大的玻璃珠，玻璃珠直徑最好大于聯通的玻璃管直徑，以免玻璃珠進入玻璃管內影響蒸汽均勻、充足的輸出； -冷凝管下端要插入硼酸吸收液液面以下，防止氨逸出，蒸餾完畢后先將冷凝管下端提離液面，再蒸1min后清洗管口，再移開吸收瓶，最后關掉熱源，否則可能發生倒吸。
常見問題解答
一、消化過程中容易沾壁怎么辦？消化后定氮瓶內有黑色殘留物怎么辦？
解答：稱樣時需要注意切勿使樣品粘附在定氮瓶頸部，避免因樣品未消化完全而造成結果偏低。消化過程中如果發生沾壁在定氮瓶肚上或者定氮瓶肚上有黑色殘留物，可以在消化較完全時搖動定氮瓶，把定氮瓶肚上的黑色物質搖洗下來。搖動的方法是取下小漏斗，戴上防燙手套，手掌緊握瓶頸，向前后側甩，使瓶內液體呈半旋轉半振蕩狀態，注意控制力度不要讓液體濺離瓶口。
二、硫酸鉀的作用是催化劑嗎？
解答：硫酸鉀的作用是提高溶液沸點，從而加快有機物分解。
三、硫酸銅是否是消化終點以及加堿蒸餾時的指示劑？
解答：硫酸銅的作用有三個，分別為：
①催化作用：加速有機物的氧化分解。
②消化完全的指示劑：使液體呈現藍綠色澄清透明狀態。
③蒸餾時堿性反應的指示劑：產生褐色沉淀。
四、混合指示劑必須臨用時混合嗎？
解答：混合指示劑必須臨用時混合。
五、蒸餾的時取下錐形瓶需要用洗瓶沖洗嗎？不沖洗會有誤差嗎？
解答：需要沖洗冷凝管下端以防止產生結果誤差。蒸餾后移動蒸餾液接收瓶,液面離開冷凝管下端,再蒸餾1min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部,然后取下蒸餾液接收瓶。
六、蒸餾儀器的檢漏如何操作？
解答：可以將蒸餾裝置連接好后，在接口以及瓶塞等可能漏氣的地方滴加少量水，打開電爐加熱，觀察有無氣泡產生
七、硼酸可以多加嗎？
解答：不可以。按國標的要求正確操作，10mL硼酸足夠。
八、滴定時消耗了很多鹽酸溶液，能否換濃度高的鹽酸溶液滴定？
解答：不能更改國標給出的滴定液濃度。蛋白質含量較高的樣品可以適當減少稱樣量，或合理范圍內減少吸取消化液的體積V3。
九、空白消耗標準滴定液的體積指的是什么？
解答：試劑空白實驗消耗的標準滴定溶液的體積就是空白體積。
十、同時有兩種蛋白怎么換算？
解答：同時含有多種蛋白質，且折算系數不相同時可以按復合配方食品換算蛋白質系數。
結語：凱氏定氮法經典、準確，適用于食品中蛋白質的測定。但是因樣品中一般會含有一些非蛋白質的含氮化合物，所以凱氏定氮法測定結果為樣品中粗蛋白質含量。然而，此法實際上測的不是蛋白質含量，而是通過測氮含量來推算出樣品中蛋白質的含量。在凱氏定氮法中消化操作的條件是產生誤差的主要原因，因此要格外注意。在實際的生產實驗中，每一步應該嚴格按照標準的規定來進行操作。本文為筆者日常工作實驗總結所得，望對實驗者有些許幫助。
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