第一法適用于以糧食和其副產(chǎn)品豆餅，麩皮等為原料釀造或配制的醬油，以糧食為原料釀造的醬類(lèi)，以黃豆,小麥粉為原料釀造的豆醬類(lèi)食品中氨基酸態(tài)氨的測(cè)定；第二法適用于以糧食和其副產(chǎn)品豆餅、麩皮等為原料釀造或配制的醬油中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定。

第一法 酸度計(jì)法

一、原理

利用氨基酸的兩性作用，加人甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性。用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定后定量，以酸度計(jì)測(cè)定終點(diǎn)。

除非另有說(shuō)明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T 6682規(guī)定的三級(jí)水。

二、試劑

甲醛(36%~ 38%):應(yīng)不含有聚合物(沒(méi)有沉淀且溶液不分層)。

酚酞。

乙醇。

鄰苯二甲酸氫鉀:基準(zhǔn)物質(zhì)。

三、試劑配制

氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[c(NaOH)-0.050mol/L]:經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液或配制方法如下：

a)酚酞指示液:稱(chēng)取酚酞1 g溶于95%的乙醇中,用95%乙醇稀釋至100 ml。

b)氫氧化鈉溶液[氯氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液c(NaOH)=0.05 mol/L]：稱(chēng)取 110 g氫氧化鈉于250mL的燒杯中，加100ml的水，振搖使之溶解成飽和溶液，冷卻后置于聚乙烯的塑料瓶中,密塞.放置數(shù)H ，澄清后備用。取上層清液2.7 mL加適量新煮沸過(guò)的冷蒸餾水至1 000 mL,搖勻。

c)氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的標(biāo)定：準(zhǔn)確稱(chēng)取約0.36 g在105℃~110℃干燥至恒重的基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀,加80 mL新煮沸過(guò)的水,使之盡量溶解,加2滴酚酞指示液(10 g/L),用氫氧化鈉溶液滴定至溶液呈微紅色,30 s不褪色。記下耗用氫氧化鈉溶液毫升數(shù)。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

c-氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的實(shí)際濃度。單位為摩爾每升(mol/L)；

m-基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀的質(zhì)量。單位為克(g)；

V1-氯氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量體積。單位為毫升(mL)；

V2-空白實(shí)驗(yàn)中氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量體積。單位為毫升(mL)；

0.2042--與1.00 ml.氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[e(NaOH)= 1.000 mol/L]相當(dāng)?shù)幕鶞?zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀的質(zhì)量。單位為克(g)。

四、儀器和設(shè)備

酸度計(jì)(附磁 力攪拌器)。

10 ml微量破式滴定管。

分析天平:感量0.1 mg。

五、分析步驟

1、醬油試樣

稱(chēng)量5.0g試樣于50mL的燒杯中,用水分?jǐn)?shù)次洗入100mL容量瓶中,加水至刻度，混勻后吸取20.0mL，置于200 ml燒杯中，加60 mL水，開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液[e(NaOH)=0.050 mol/L3}滴定至酸度計(jì)指示pH為8.2，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)，可計(jì)算總酸含量。加入10.0 mL甲醛溶液,混勻。再用氯氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液繼續(xù)滴定至pH為9.2，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)。同時(shí)取80 ml水。先用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液[e(NaOH)= 0.050 mol/L]調(diào)節(jié)至pH為8.2，再加人10.0 mL甲醛溶液.用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至pH為9.2，做試劑空白試驗(yàn)。

2、醬及黃豆醬樣品

將醬或黃豆醬樣品攪拌均勻后，放入研缽中，在10min內(nèi)迅速研磨至無(wú)肉眼可見(jiàn)顆粒,裝人磨口瓶中備用。用已知重量的稱(chēng)量瓶稱(chēng)取攪拌均勻的樣品5.0g用50mL80℃左右的燕餾水分?jǐn)?shù)次洗入100ml.燒杯中，冷卻后，轉(zhuǎn)人100ml容量瓶中，用少量水分次洗滌燒杯洗液并入容量瓶中并加水至刻度混勻后過(guò)能。吸取濾液10.0 mL置于200 ml燒杯中，加60 mL水，開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液[e(NaOH) = 0.050 mol/L]滴定至酸度計(jì)指示pH為8.2記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù),可計(jì)算總酸含量。加人10.0mL甲醛溶液混勻。再用氣氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液繼續(xù)滴定至pH為9.2記下消耗氯氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)。同時(shí)取80ml.水，先用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液[e(NaOH)=0.050mol/L]調(diào)節(jié)至pH為8.2再加入10.0ml甲醛溶液,用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至pH為9.2做試劑空白試驗(yàn)。

六、分析結(jié)果的表述

試樣中氨基酸態(tài)氨的含量按式(2)進(jìn)行計(jì)算:

式中:

X一 試樣中氨基酸態(tài)氮的含量,單位為克每百克(g/100 g)；

V1一測(cè)定用試樣稀釋液加入甲醛后消耗氯氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，單位為毫升(mL)；

V2-試劑空白實(shí)驗(yàn)加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積,單位為毫升(mL)；

C-氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度,單位為摩爾每升(mol/L)；

0.014--與1.00 ml氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[<(NaOH)= 1.000 mol/L.]相當(dāng)?shù)牡�的質(zhì)量，單位為克(g)；

m-稱(chēng)取試樣的質(zhì)量,單位為克(g)；

V3一試樣稀釋液的取用量,單位為毫升(mL)；

V4一試樣稀釋液的定容體積.單位為毫升(mL)；

100一單位換算系數(shù)。

計(jì)算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

七、精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。

第二法、比色法

一、原理

在pH為4.8的乙酸鈉乙酸緩沖液中，氨基酸態(tài)氣與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的3.5-二乙酸-2.6-二甲基-1.4二氫化吡啶氨基酸衍生物。在波長(zhǎng)400 nm處測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。

二、試劑和材料

除非另有說(shuō)明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。

試劑

乙酸:無(wú)水乙酸鈉或 乙酸鈉。

甲醇。

乙酰丙酮。

三、試劑配制

乙酸溶液(1 mol/L)：量取5.8 ml冰乙酸，加水稀釋至100 ml.

乙酸鈉溶液(1 mol/L)：稱(chēng)取41 g無(wú)水乙酸鈉或68 g乙酸鈉。加水溶解后并稀釋至500 ml。

乙酸鈉 乙酸緩沖液：量取60 ml乙酸鈉溶液(1 mol/L)與40 ml乙酸溶液(1mol/L)混合,該溶液pH為4.8。

顯色劑:15 ml 37%甲醇與7.8 ml乙酰丙酮混合,加水稀釋至100ml,劇烈振搖混勻(室溫下放置穩(wěn)定3d)。

四、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

氨氮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1.0 mg/mL)：精密稱(chēng)取105 ℃干燥2 h的硫酸銨0.4720g于小燒杯中，加水溶解后移至100 ml容量瓶中，并稀釋至刻度，混勻。此溶液每毫升相當(dāng)于1.0 mg氨氮(10℃下冰箱內(nèi)貯存穩(wěn)定1年以上)。

氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(0.1 g/L):用移液管精確量取10 ml。氨氮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.0 mg/mL)于100 ml容量瓶?jī)?nèi)。加水稀釋至刻度,混勻,此溶液每毫升相當(dāng)于100 ug氨氮(10 ℃下冰箱內(nèi)貯存穩(wěn)定1個(gè)月)。

五、儀器和設(shè)備

分光光度計(jì)。

電熱恒溫水浴鍋(100 ℃士0.5 ℃)。

10 mI具塞玻璃比色管。

六、 分析步驟

1、 試樣前處理

稱(chēng)量1.00g試樣于50ml容量瓶中,加水稀釋至刻度,混勻。

2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密吸取氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液0 mL、0.05 m1、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 ml、1.0 mL分別于10 ml比色管中。向各比色管分別加人4mI乙酸鈉乙酸緩沖溶液(pH4.8)及4ml顯色劑，用水稀釋至刻度,混勻。置于100 ℃水浴中加熱15 min，取出，水浴冷卻至室溫后。移入1cm比色阻內(nèi)，以零管為參比,于波長(zhǎng)400nm處測(cè)量吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算直線回歸方程。

3、試樣的測(cè)定

精密吸取2 ml試樣稀釋溶液于10 ml比色管中。加入4 ml乙酸鈉乙酸緩沖溶液(pH4.8)及4 mL顯色劑,用水稀釋至刻度,混勻。置于100℃水浴中加熱15 min.取出,水浴冷卻至室溫后,移入1cm比色皿內(nèi)，以零管為參比，于波長(zhǎng)400nm處測(cè)量吸光度。試樣吸光度與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量或代人標(biāo)準(zhǔn)回歸方程.計(jì)算試樣含量。

七、分析結(jié)果的表述

試樣中氨基酸態(tài)氮的含量按式(3)進(jìn)行計(jì)算:

式中:

X一試樣中氨基酸態(tài)氮的含量，單位為克每百克(g/ 100 g)；

m-試樣測(cè)定液中氮的質(zhì)量，單位為微克(ug)；

m1-稱(chēng)取試樣的質(zhì)量，單位為克(g)；

V1一測(cè)定 用試樣溶液體積，單位為毫升(mL)；

V2-試樣前處理中的定容體積，單位為毫升(ml)；

八、精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。

九、其他

本方法的檢出限為0.0070 mg/100 g。定量限為0.0210 mg/100g。