近年來(lái),芯片介電電泳研究已從最初對(duì)生化樣品的簡(jiǎn)單富集操作,擴(kuò)展到對(duì)納米材料、金屬顆粒等物質(zhì)的富集、分離和操控等[1~3]諸多方面。將介電電泳技術(shù)與流體力[4]、電場(chǎng)力[5]、激光鑷子[6]等模式結(jié)合也成為研究的新方向,而芯片介電電泳分析系統(tǒng)中的微電極結(jié)構(gòu)是決定分析效能的關(guān)鍵因素之一。因此,設(shè)計(jì)出分離性能更高、結(jié)構(gòu)更合理的微電極一直是人們關(guān)注的重點(diǎn),目前,介電電泳電極構(gòu)型已由過(guò)去傳統(tǒng)的平面式電極向三維式電極發(fā)展,出現(xiàn)了夾板式電極、籠式電極和絕緣柱式電極等[7,8]多種構(gòu)型。相比于常規(guī)電泳分析生化樣品時(shí)必須對(duì)樣品對(duì)象進(jìn)行復(fù)雜預(yù)處理或前衍生的缺陷,芯片介電電泳技術(shù)可依據(jù)樣品本身介電性質(zhì),在不進(jìn)行預(yù)處理的情況下直接對(duì)樣品進(jìn)行DEP富集操控,從而最大限度保持了樣品的生理活性;同時(shí)介電電泳芯片采用MEMS技術(shù)加工制作,整個(gè)操作過(guò)程都易于調(diào)控和實(shí)現(xiàn)集成化、自動(dòng)化;芯片DEP過(guò)程中大多采用低壓高頻交流信號(hào)源,易于實(shí)現(xiàn)與其它分析方法的聯(lián)用。芯片介電電泳由于具有以上特點(diǎn)使其在生化樣品分析方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

     介電電泳芯片分析系統(tǒng)通常由樣品進(jìn)樣和DEP驅(qū)動(dòng)單元、樣品富集和分離單元以及檢測(cè)單元3部分構(gòu)成。樣品富集和分離過(guò)程在具有微電極或絕緣體結(jié)構(gòu)的介電電泳芯片上實(shí)現(xiàn)。樣品進(jìn)樣是通過(guò)在介電電泳芯片微通道兩端施加DEP直流信號(hào)或注射微泵驅(qū)使溶液流動(dòng)來(lái)完成的。由交流信號(hào)激發(fā)的介電電泳稱(chēng)為交流式介電電泳(AC-DEP),交流信號(hào)連接在芯片微電極上用以激發(fā)分析對(duì)象極化,實(shí)現(xiàn)DEP富集分離樣品的目的;直流信號(hào)激發(fā)的介電電泳稱(chēng)為直流式介電電泳(DC-DEP),直流信號(hào)直接加在芯片微管道兩端,利用微管道內(nèi)的絕緣體使管道內(nèi)的電力線(xiàn)發(fā)生扭曲,產(chǎn)生非均勻電場(chǎng)實(shí)現(xiàn)樣品的DEP富集操控。

DEP芯片的微電極構(gòu)型是決定樣品富集位置的重要因素。常規(guī)介電電泳芯片的電極構(gòu)型包括堡式電極、拋物線(xiàn)式電極、叉指式電極和圓點(diǎn)式陣列電極等。目前,三維式電極結(jié)構(gòu)由于其富集操控手段的靈活性和電極設(shè)計(jì)和制作形式的多樣性,也是目前研究的熱點(diǎn)。AC-DEP模式是最初人們研究介電電泳現(xiàn)象時(shí)采用的DEP信號(hào)驅(qū)動(dòng)模式,進(jìn)入本世紀(jì)后,人們開(kāi)始探索DC-DEP和可實(shí)現(xiàn)樣品連續(xù)富集分離的流動(dòng)式分離模式。

     介電電泳分析中最普遍的檢測(cè)手段仍是CCD顯微成像或熒光顯色CCD顯微成像技術(shù),通過(guò)顯微鏡觀測(cè)分析對(duì)象在介電電泳力代寫(xiě)論文下的富集分離情況獲取分析信息。除了常規(guī)的CCD顯微成像檢測(cè)手段,將電化學(xué)檢測(cè)手段與芯片DEP模式耦合,是現(xiàn)今DEP檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)[9]。

     利用芯片介電電泳進(jìn)行生物樣品的富集和分離時(shí),樣品可在DEP作用下根據(jù)自身物理性質(zhì)的差異富集在DEP芯片的不同位置。單純依靠DEP作為分離富集驅(qū)動(dòng)力時(shí),只能實(shí)現(xiàn)微粒的靜態(tài)原位富集和分離,將這種模式稱(chēng)為靜態(tài)原位富集模式。當(dāng)介電電泳力與其它分離方法結(jié)合時(shí)實(shí)現(xiàn)的連續(xù)動(dòng)態(tài)富集分離過(guò)程,稱(chēng)為動(dòng)態(tài)富集分離模式。

     DEP靜態(tài)原位富集模式是介電電泳研究中最早采用的模式,這時(shí)樣品富集位置主要取決于DEP芯片中微電極構(gòu)型的變化,不同的微電極結(jié)構(gòu)所對(duì)應(yīng)的正負(fù)DEP富集位置不同,樣品依據(jù)自身介電性質(zhì)差異受不同類(lèi)型DEP作用,富集于芯片的不同位置。

Xu等[10]在帶有堡式電極的介電電泳芯片上觀測(cè)到了紅細(xì)胞的介電電泳現(xiàn)象。Ramadan等[11]在堡式電極結(jié)構(gòu)上實(shí)現(xiàn)了白血球(WBS)、小鼠無(wú)性細(xì)胞(MN9D)和酵母菌的介電電泳富集,并利用電穿孔技術(shù)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的電溶解(圖1),其管道內(nèi)溶液流速與細(xì)胞融膜率成反比。Arnold等[12]制作了一種可以捕獲和培育細(xì)胞的具有類(lèi)堡式電極結(jié)構(gòu)的DEP芯片,通過(guò)控制交流信號(hào)使酵母菌在負(fù)介電電泳(nDEP)和重力作用下懸浮在分離通道內(nèi),降低交流信號(hào)頻率,使酵母菌沉降以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞富集,并在片上進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),實(shí)現(xiàn)了一系列的細(xì)菌懸浮、富集和片上培養(yǎng)操作。

     Li等[13]應(yīng)用平行陣列電極實(shí)現(xiàn)了微芯片上死活李斯特菌的原位分離富集,并通過(guò)對(duì)細(xì)菌熒光染色后區(qū)分其活性,再進(jìn)行熒光顯微成像檢測(cè)。Zhou等[14]設(shè)計(jì)了一種可以產(chǎn)生交流電滲擴(kuò)增的介電電泳芯片,芯片電極為三維構(gòu)型,底面采用陣列電極結(jié)構(gòu),頂面電極為覆蓋整個(gè)微管道的面電極,在這種裝置上實(shí)現(xiàn)了膠體微粒/酵母菌、紅細(xì)胞/酵母菌混合樣品體系的原位富集分離,并對(duì)這種情況下樣品所受的重Fig. 1　Image of enrichment and lysis process steps of WBC[11]

     圖2  拋物線(xiàn)式電極結(jié)構(gòu)上溶壁微球菌和大腸桿菌混合樣品的分離[15]Fig. 2  Separation of M.lysodeikticusand E.colion the microchip witha quadrupole electrode[15]力、DEP力和交流電滲力做了理論探討。Pethig[15]在拋物線(xiàn)式電極上實(shí)現(xiàn)了酵母菌的正介電電泳(pDEP)和負(fù)介電電泳(nDEP)富集,以及溶壁微球菌和大腸桿菌混合樣品的分離,并利用這一裝置研究了樣品的生理特性。圖2為溶壁微球菌和大腸桿菌在該裝置上的分離圖像。Abidin等[16]制作了一種可產(chǎn)生高梯度電場(chǎng)的DEP分離(HGES)系統(tǒng),這種DEP分離裝置由兩個(gè)同心圓柱構(gòu)成,圓柱與交流信號(hào)源接通,圓柱中間填充玻璃微珠用以產(chǎn)生高梯度的非均勻電場(chǎng),以釀酒酵母為樣品討論了這種裝置的捕獲效率,并討論了同心電極尺寸和玻璃微珠直徑對(duì)細(xì)菌捕獲效率的影響。

     Ho等[17]設(shè)計(jì)了一種同心星狀電極結(jié)構(gòu)的DEP芯片,一系列的同心圓電極結(jié)構(gòu)擴(kuò)增了DEP信號(hào),有效增強(qiáng)了系統(tǒng)的DEP富集效率。利用這一裝置富集肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,并采用熒光染色方式進(jìn)行后續(xù)檢測(cè),裝置結(jié)構(gòu)圖和實(shí)驗(yàn)圖像如圖3所示。

圖3  同心星狀電極DEP芯片[17]Fig. 3　On-chip heterogeneous-cells patterning demonstration[17]在DEP分離中,樣品除了受DEP力作用外,在電極附近還會(huì)受到電滲流作用使樣品發(fā)生擾動(dòng),通常情況下,分析體系中的電極和樣品都是μm尺度的,電滲流對(duì)DEP作用的負(fù)面影響往往可以忽略不計(jì),但當(dāng)樣品微粒小至nm尺度時(shí),這一影響就不容忽視。為了消除電滲流對(duì)納米微粒富集的影響, Luo等[18]制作了一種電極寬度在nm級(jí)的DEP芯片,實(shí)現(xiàn)了納米級(jí)聚苯乙烯微粒和牛血清白蛋白(BSA)的DEP富集。

2·2　芯片介電電泳的分離富集模式單純依靠常規(guī)的電極構(gòu)型產(chǎn)生DEP力對(duì)樣品進(jìn)行介電富集和分離時(shí),很難實(shí)現(xiàn)樣品的連續(xù)分離和快速檢測(cè)。因此,設(shè)計(jì)出結(jié)構(gòu)合理、利于實(shí)現(xiàn)連續(xù)測(cè)定的電極構(gòu)型或者將其它分離技術(shù)與芯片介電電泳技術(shù)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)樣品的連續(xù)富集分離和操控是近年來(lái)芯片介電電泳研究的熱點(diǎn)。2·2·1　DEP與流體力偶合分離　程京等[19]采用棋盤(pán)式陣列電極(5×5)將DEP力和流體力結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了外周血細(xì)胞(Blood細(xì)胞)中宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)的連續(xù)富集和分離。實(shí)驗(yàn)采用Tris-硼酸緩沖液,分離條件為6V、30kHz,緩沖液流速控制在200μL/min,此時(shí)HeLa細(xì)胞受pDEP作用被富集在電極表面,而B(niǎo)lood細(xì)胞受nDEP作用富集在電極之間,之后利用流體力將Blood細(xì)胞沖入廢液池,而Hela細(xì)胞仍富集在電極表面,利用熒光染料對(duì)富集在電極表面的HeLa細(xì)胞染色后,進(jìn)行顯微成像檢測(cè)。Doh等[20]設(shè)計(jì)了一種可實(shí)現(xiàn)樣品連續(xù)富集分離的微流控DEP芯片(圖4),細(xì)胞混合樣品注入具有三電極結(jié)構(gòu)的微管道內(nèi),受pDEP作用的樣品偏離管道中心向管道兩邊富集而從出口1流出,受nDEP作用的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方向不變從出口2流出,由此實(shí)現(xiàn)死活酵母菌的連續(xù)流動(dòng)分離。結(jié)果表明,細(xì)菌分離效圖4　連續(xù)介電電泳DEP分離過(guò)程示意圖[20]

     Fig. 4　Scheme of hydrodynamic dielectrophoresis (DEP)process[20]率與溶液流速成反比。Suehiro等[21]將抗體固定到叉指電極式DEP芯片表面,利用pDEP力將混合樣品富集到芯片表面,利用抗原和抗體的特異性吸附作用,使靶細(xì)胞與固定在芯片表面的抗體結(jié)合,再利用液流將非靶細(xì)胞沖走,實(shí)現(xiàn)了兩種特定細(xì)胞的流動(dòng)式介電富集和分離過(guò)程。Yang等[22]將該方法用于李斯特菌的介電誘捕免疫富集。Voldman等[23]在傳統(tǒng)叉指電極式DEP芯片的基礎(chǔ)上,在分離通道頂部采用SU-8制作了一系列無(wú)序攪拌凹槽,使溶液形成湍流,增加樣品與電極的接觸幾率,利用pDEP作用將樣品富集于電極表面。該設(shè)計(jì)中攪拌凹槽的引入間接提高DEP富集效率,可以明顯提高聚苯乙烯微珠和B.subtilis孢子的富集效果。

     Li等[24]設(shè)計(jì)了一種將進(jìn)樣、餾分和樣品收集三個(gè)單元集成在一起的芯片。在進(jìn)樣區(qū)域,通過(guò)液鞘的夾流作用控制樣品寬度,餾分單元部分管道底部布有平行電極(電極寬度和間距均為10μm)用以產(chǎn)生非均勻電場(chǎng),完成細(xì)胞樣品的分離和篩選,最后,經(jīng)過(guò)分離篩選的細(xì)胞樣品從兩個(gè)出液口排出而被收集。他們對(duì)該芯片進(jìn)樣區(qū)域的微流控過(guò)程進(jìn)行了計(jì)算機(jī)模擬,并采用酵母菌為模板樣本對(duì)裝置的分離效果進(jìn)行了驗(yàn)證。Cummings等[25]提出了絕緣式介電電泳(iDEP)的概念。在常規(guī)的十字芯片內(nèi)刻蝕一系列絕緣體柱,將直流電信號(hào)施加在芯片微管道兩端,通過(guò)管道內(nèi)的絕緣體柱擾動(dòng)電力線(xiàn)以形成非均勻電場(chǎng)。他們對(duì)DC-DEP模式的理論分析和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在此模式下微粒會(huì)經(jīng)歷流動(dòng)式介電電泳(streaming-DEP)和誘捕式介電電泳(trapping-DEP)2種狀態(tài);不同絕緣體形狀(圓形陣列電極、菱形陣列電極)、絕緣體直徑以及絕緣體間夾角變化對(duì)通道內(nèi)電場(chǎng)強(qiáng)度梯度分布也有影響。他們對(duì)活性大腸桿菌(E.coli)和失活的E.coli的混合樣品進(jìn)行了連續(xù)富集和分離[26];實(shí)現(xiàn)了污水[27]中E.coli、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌枯草芽孢桿菌(B.subtilis spores)、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)和巨大芽孢桿菌(B.megaterium)的兩兩富集分離;富集了革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌枯草芽孢桿菌(B.subtilis spores)、煙草花葉病病毒(TMV)和E.coli單樣品[8],其中E.coli的富集效率接近100%。他們的研究引起了分析工作者對(duì)DC-DEP分析模式的濃厚興趣。Kang等[28]設(shè)計(jì)了另一種結(jié)構(gòu)的DC-DEP芯片,利用分離通道中絕緣的聚苯乙烯鏈段,使電力線(xiàn)發(fā)生扭曲,產(chǎn)生非均勻電場(chǎng),聚苯乙烯微球在介電電泳力和流體力的共同作用下依據(jù)微粒尺寸得到分離(如圖5所示)。Barbulovic-Nad等[29]采用油滴作為絕緣體,通過(guò)控制油滴的尺寸間接調(diào)整DEP力實(shí)現(xiàn)了不同尺寸介電微粒的連續(xù)分離。

     圖5　絕緣電極式DEP芯片分離直徑為5·7和15·7mm的聚苯乙烯微粒[28]Fig. 5　Separation of 5·7 and 15·7 mm particles by applied voltages on different electrodes at 500 V voltage level[28]2·2·2　DEP與激光鑷子耦合分離　1998年Morishima等[30]將激光鑷子技術(shù)與DEP技術(shù)結(jié)合,芯片采用拋物線(xiàn)式電極結(jié)構(gòu),通過(guò)nDEP使大腸桿菌富集,同時(shí)激光鑷子將單個(gè)樣品移動(dòng)到監(jiān)測(cè)點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析,實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞樣品的單個(gè)檢測(cè)和操控。Arai等[31]在這兩種方法耦合的基礎(chǔ)上引入流體力,將單個(gè)酵母菌樣品從分析區(qū)域轉(zhuǎn)移出微通道(圖6)。介電電泳與激光鑷子技術(shù)聯(lián)用,不能實(shí)現(xiàn)大量樣品的高效快速富集分離操作,但卻可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)樣品的精確操控,這為臨床上獲得純度為100%的生物樣品提供圖6　細(xì)胞操控過(guò)程示意圖[31]Fig. 6　Transportion trajectory ofthe target cell[31]了可能。

2·2·3　其它耦合模式的分離　Cui等[32]設(shè)計(jì)了一種行波介電電泳(twDEP)DEP芯片,其具有一系列平行陣列電極,通過(guò)在其上施加相差為90°的交流信號(hào)可實(shí)現(xiàn)樣品twDEP驅(qū)動(dòng),將樣品進(jìn)行pDEP富集于twDEP電極的初始位置,再對(duì)樣品進(jìn)行twDEP操控(圖7),實(shí)現(xiàn)了乳膠微粒和小鼠心肌細(xì)胞的電懸浮和連續(xù)流動(dòng)操控。

　　Taff等[33]給出一種可以設(shè)置細(xì)胞富集位置的pDEP細(xì)胞篩分陣列的芯片設(shè)計(jì),采用同心圓式雙層陣列電極,通過(guò)對(duì)陣列電極的定位控制,實(shí)現(xiàn)了單個(gè)人類(lèi)血癌細(xì)胞的誘捕、操控和釋放。Cheung等[34]設(shè)計(jì)了夾板式和籠式電極結(jié)合的介電電泳芯片(圖8),在359kHz~20MHz范圍內(nèi),采用阻抗檢測(cè)對(duì)經(jīng)過(guò)不同處理的紅細(xì)胞進(jìn)行分離和阻抗分析,分析速度達(dá)到1000個(gè)/min。Yasukawa等[35]提出一種能夠用于免疫分析的介電電泳芯片。該芯片采用三維電極結(jié)構(gòu),能夠在芯片微管道內(nèi)形成介電籠,將作為固相載體的聚苯乙烯固定在芯片管道中,實(shí)現(xiàn)了流動(dòng)體系中抗原與抗體的完全反應(yīng),此系統(tǒng)能夠在40min內(nèi)完成對(duì)小鼠IgG的免疫分析。