一、實(shí)驗(yàn)背景

 

1、目的：建立地榆中金絲桃苷的高效液相色譜含量測(cè)定方法。

 

2、方法：采用RP-HPLC測(cè)定，C18柱，流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸溶液(46∶54)，用三乙胺調(diào)pH至3.0，流速1.0ml·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)370nm；供試品溶液的制備采用甲醇超聲提取。

 

3、結(jié)果：測(cè)定了不同產(chǎn)地不同批次的地榆藥材，金絲桃苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.052%～0.291%。結(jié)論該方法靈敏快速，準(zhǔn)確可靠，可用于地榆的質(zhì)量控制。

 

4、意義：地榆為薔薇科植物地榆或長(zhǎng)葉地榆的干燥根。其味苦、酸、澀，微寒，具有涼血止血、解毒斂瘡之功效。現(xiàn)代藥理研究表明其具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，主要有效成分為黃酮類化合物，但藥典記載質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的定量檢測(cè)方法僅為紫外-可見分光光度法測(cè)定其鞣質(zhì)含量，該法操作繁瑣。金絲桃苷為地榆藥材中提取得到的黃酮類化合物。研究表明，地榆中的金絲桃苷是其止痛作用的有效成分之一。本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC法對(duì)不同產(chǎn)地中藥材市場(chǎng)商品地榆的金絲桃苷成分進(jìn)行了定量分析，考察了流通商品地榆的質(zhì)量狀況，為進(jìn)一步提高地榆藥材的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

 

二、儀器與試藥

 

1、高效液相色譜儀，含在線脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、智能柱溫箱、紫外可見光檢測(cè)器(VWD)、化學(xué)工作站。超聲波清洗器。

 

2、地榆的干燥根或飲片。實(shí)驗(yàn)中將樣品粉碎后過100目篩，置干燥器中備用。

 

3、金絲桃苷(111521-200303，國(guó)藥品生物制品檢定所,供含量測(cè)定用)。甲醇為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。其他試劑均為分析純。

 

三、方法與結(jié)果

 

1、對(duì)照品溶液的制備

 

精密稱取金絲桃苷13.25mg，置量瓶中，加甲醇定容至25ml，其金絲桃苷含量為0.53mg·ml-1。再精密吸取金絲桃苷對(duì)照品溶液2.0ml，加甲醇定容至50ml量瓶中，其金絲桃苷含量為0.0212mg·ml-1。

 

2、供試品溶液的制備

 

取地榆干燥藥材或飲片的粉末(過100目)1g，分別精密稱定，至具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100ml，稱定重量，超聲提取1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，用續(xù)濾液作為供試品溶液。

 

3、色譜條件

 

HypersilODS2分析柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相甲醇-0.2%磷酸溶液(46：54)，用三乙胺調(diào)pH至3.0；流速1.0ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)370nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量10μl；在選定的色譜條件下，色譜柱的分離效率(簡(jiǎn)稱柱效)>理論塔板數(shù)以金絲桃苷峰計(jì)算不低于3000。分離度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05。

 

4、檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

 

取金絲桃苷對(duì)照品適量，用甲醇溶解后作紫外全波長(zhǎng)掃描，λ286，370nm,因286nm下非黃酮物質(zhì)也有吸收，為避免干擾，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為370nm。

 

5、線性關(guān)系的考察

 

分別精密吸取0.0212mg·ml-1的金絲桃苷對(duì)照品溶液2，4，6，8，10，12，16μl注入液相色譜儀，測(cè)定基線構(gòu)成之面積稱峰面積。A＝×σ×h＝2.507σh＝1.064Wh/2h>峰面積，以金絲桃苷含量(X)為橫坐標(biāo)，其峰面積吸收度積分值(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：Y=2263.9X 2.9635，r=0.9998(n=7)，表明金絲桃苷在0.04～0.34μg線性關(guān)系良好。

 

6、精密度實(shí)驗(yàn)

 

精密吸取0.0212mg·ml-1金絲桃苷對(duì)照品溶液10μl，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積積分值RSD為0.86%，表明精密度良好。

 

7、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

 

精密稱取同一樣品粉末1g(5份)，按供試品溶液的制備方法制備，進(jìn)樣10μl，測(cè)得金絲桃苷含量的RSD為0.99%，表明該方法的重復(fù)性好。

 

8、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)同一供試品溶液，從制備完畢開始放置，分別于0，2，4，6，8，10h進(jìn)樣檢測(cè)，其峰面積積分值RSD為1.9%。表明供試品溶液在10h內(nèi)比較穩(wěn)定。

 

9、加樣回收率實(shí)驗(yàn)

 

取已知含量的藥材(6號(hào)含量1.60mg·g-1)樣品6份，每份0.50g，精密稱定，計(jì)算樣品中金絲桃苷量，分別加入適量的金絲桃苷對(duì)照品，按樣品制備方法和測(cè)試條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。

 

10、樣品測(cè)定

 

分別精密吸取各樣品10μl進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量。

 

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論

 

1、提取條件的選擇

 

根據(jù)金絲桃苷的溶解性能，選擇乙醇、甲醇、醋酸乙酯作為提取溶劑，比較了3種提取溶劑提取方法(超聲、回流及索氏提取)和不同提取時(shí)間(0.5，1.0，1.5h)對(duì)提取效果的影響。結(jié)果顯示采用超聲提取方法的提取率最高，甲醇提取效果最好，含量結(jié)果表明超聲提取1.0h可使待測(cè)成分提取完全。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，含量并未隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)而有所增加，超過1h時(shí)含量甚至有下降的趨勢(shì)。

 

2、流動(dòng)相的選擇

 

由于金絲桃苷為黃酮類化合物，本實(shí)驗(yàn)采用甲醇和0.2%磷酸溶液的二元流動(dòng)相體系，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)拖尾峰(tailingpeak)。前者少見。>色譜峰有拖尾現(xiàn)象。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在1000ml的0.2%磷酸溶液中加入1.8ml三乙胺時(shí)的分離效果最佳，經(jīng)多次，多批樣品測(cè)試，系統(tǒng)具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，三乙胺能與ODS柱中鍵合相的殘余硅醇基相互作用，提高分離度，有助于改善峰形。因此以甲醇-0.2%磷酸溶液(46∶54)用三乙胺調(diào)pH至3.0為優(yōu)，分離效果較好，保留時(shí)間適中，且無干擾［3］。本方法操作簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，適用于地榆中金絲桃苷含量的測(cè)定。

 

3、樣品分析

 

對(duì)不同產(chǎn)地地榆中的金絲桃苷含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地金絲桃苷的含量存在著一定的差異，有必要對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制。