ATP是化學(xué)物質(zhì)三磷酸腺苷的簡(jiǎn)稱，存在于所有的生物體中（從微生物到高等動(dòng)物），ATP在細(xì)胞體內(nèi)主要作用是提供能量。鑒于ATP存在于所有生物體中，利用ATP發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)ATP，可以間接地證明生物體的存在。隨著食品行業(yè)對(duì)食品衛(wèi)生質(zhì)量要求越來越高，而且ATP生物發(fā)光法在檢測(cè)食品微生物時(shí)簡(jiǎn)單、快速且靈敏度高，因此近年來受到廣泛關(guān)注。
 

ATP生物發(fā)光技術(shù)產(chǎn)生于20世紀(jì)70年代中期。1983年，Moyer等最早提出細(xì)胞內(nèi)源性ATP的含量可以反映細(xì)胞的活性和活細(xì)胞的數(shù)量。同年Gronroos等也證實(shí)該技術(shù)是一種可靠、靈敏度高的確定細(xì)胞活性度的檢測(cè)方法。20世紀(jì)80年代，英國人首先研制出ATP檢測(cè)儀檢測(cè)系統(tǒng)，隨后發(fā)展到歐洲、美國和日本。應(yīng)用范圍涉及食品加工、超市和飲食行業(yè)，檢測(cè)內(nèi)容包括微生物和食品殘?jiān)��?998年，日本國會(huì)頒布了《關(guān)于食品制造過程管理高度化臨時(shí)措施法》，其中即包含了應(yīng)用ATP檢測(cè)儀檢測(cè)系統(tǒng)的內(nèi)容。1999年，日本還成立了ATP涂抹檢查研究會(huì)，專門研究該方法的使用效率和應(yīng)用領(lǐng)域，其內(nèi)容之一就是在食品衛(wèi)生監(jiān)測(cè)領(lǐng)域中，解決現(xiàn)場(chǎng)微生物的檢測(cè)問題。20世紀(jì)末，一些ATP檢測(cè)儀檢測(cè)系統(tǒng)及技術(shù)被引進(jìn)我國，到目前為止，除個(gè)別省級(jí)衛(wèi)生監(jiān)督檢測(cè)單位裝備外，主要是在一些外資或合資企業(yè)中自行檢測(cè)使用。2002年，我國衛(wèi)生部頒發(fā)了食品加工企業(yè)HACCP實(shí)施指南，鼓勵(lì)食品加工企業(yè)引入ATP檢測(cè)系統(tǒng)。近年來，蟲熒光素酶已通過基因工程生產(chǎn)，價(jià)格大幅度降低，隨著相關(guān)儀器的小型化，ATP生物發(fā)光技術(shù)必將會(huì)在國內(nèi)相關(guān)行業(yè)得到迅速普及 。
 

2.1  ATP生物發(fā)光法菌落計(jì)數(shù)

ATP廣泛存在于各種活的生物體中，活的菌體中也含有ATP。細(xì)菌死亡后，在細(xì)胞內(nèi)酶的作用下，將很快被分解掉。ATP生物熒光檢測(cè)是基于生物發(fā)光體系的發(fā)光機(jī)理所設(shè)計(jì)，螢火蟲具有特殊的發(fā)光物質(zhì)——蟲熒光素及熒光素酶，熒光素易被氧化，它在熒光素酶催化下，由ATP激活，使之與氧結(jié)合，熒光素分子中的電子躍遷到高能級(jí)，處于不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子跳回到低能級(jí)時(shí)，即發(fā)出熒光光子。該光的強(qiáng)度與被檢測(cè)物質(zhì)中所含的ATP量成正比，利用高靈敏度的儀器測(cè)定光的強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。因此，通過測(cè)定樣品中ATP的濃度，即可推算出活菌數(shù)。生物發(fā)光法的檢測(cè)步驟大體包括：棉拭取樣、樣品萃取、添加熒光素和熒光素酶混合物、測(cè)定生物發(fā)光量、做出標(biāo)準(zhǔn)曲線、求出濃度和活菌數(shù)。通常，細(xì)菌表層有細(xì)胞膜和細(xì)胞壁包裹，故樣品未經(jīng)處理是不能測(cè)定的。測(cè)定時(shí)需先將樣品與微生物用提取試劑混合，使細(xì)胞膜和細(xì)胞壁開孔，提取出ATP提取試劑是以表面活性劑為基質(zhì)的專用試劑。然后，再與熒光素和熒光素酶生物發(fā)光試劑作用，用熒光儀測(cè)定與發(fā)光試劑反應(yīng)的生物發(fā)光量。

這種方法可自動(dòng)化操作，靈敏度高，可以達(dá)到10-12 mol/L；檢測(cè)速度快，相比表面皿培養(yǎng)法，僅需十幾分鐘就可以完成一個(gè)樣本的檢測(cè)；檢測(cè)范圍廣，此種方法不僅可以檢測(cè)微生物，還可以對(duì)食品生產(chǎn)設(shè)備的清潔度、酵母菌，乳酸菌等菌種的發(fā)酵活性等進(jìn)行檢測(cè)。沈陽中科靚馬生物工程有限公司從中科院遺傳與發(fā)育所引進(jìn)了“含蟲光素基因的新型菌株及蟲光素酶的生產(chǎn)方法”發(fā)明專利，成功研發(fā)了具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的“ATP熒光法細(xì)菌總數(shù)快速檢測(cè)系統(tǒng)”，系統(tǒng)采用了先進(jìn)的ATP生物發(fā)光技術(shù)，只要測(cè)定出相對(duì)熒光值，依據(jù)相對(duì)熒光值與細(xì)菌總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，幾分鐘內(nèi)即可快速得出樣品中的細(xì)菌總數(shù)。2008年周愛玉等對(duì)手持式ATP生物熒光檢測(cè)儀進(jìn)行研制，取得了良好的結(jié)果。下圖即是兩款不同的類型，其中左側(cè)被稱之為掌上ATP發(fā)光法檢測(cè)儀，使檢測(cè)更加方便。

2.2 傳統(tǒng)菌落技術(shù)法

菌落總數(shù)的測(cè)定，一般將被檢樣品制成幾個(gè)不同的10倍遞增稀釋液，然后從每個(gè)稀釋液中分別取出1mL置于滅菌平皿中與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，在一定溫度下，培養(yǎng)一定時(shí)間后（一般為48小時(shí)），記錄每個(gè)平皿中形成的菌落數(shù)量，依據(jù)稀釋倍數(shù)，計(jì)算出每克（或每ml）原始樣品中所含細(xì)菌菌落總數(shù)。
 

ATP生物發(fā)光法的應(yīng)用范圍十分廣泛，現(xiàn)已應(yīng)用于食品行業(yè)的多個(gè)領(lǐng)域。研究表明，ATP生物發(fā)光法與標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)法相比，二者具有良好的相關(guān)性(r=0.98)，但怎樣細(xì)分細(xì)菌種類有一定的難度,還需要做大量的工作。利用這種方法可以對(duì)食品原料、肉類、水產(chǎn)品、蔬菜、飲料、酒類、酸奶等中微生物的含量進(jìn)行定量。此外，采用ATP生物發(fā)光法可快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)食品生產(chǎn)環(huán)境的清潔度。對(duì)ATP 含量的檢測(cè)是以相對(duì)發(fā)光值(Relative Light Unit ,簡(jiǎn)稱RLU)表示的。隨著RLU值的降低，微生物的檢出幾率也降低。實(shí)驗(yàn)證明：如果將RLU值以100～1000作為界限，RLU值不滿100時(shí)，微生物檢出幾率為0，RLU值在100～1000范圍內(nèi)時(shí)，微生物檢出幾率為30%，RLU值超過1000時(shí)，微生物檢出幾率為96%。根據(jù)這一結(jié)果，在日常對(duì)食品生產(chǎn)設(shè)備或與食品密切接觸設(shè)備清潔度的檢測(cè)時(shí)，可以將RLU值不滿100時(shí)視為安全，RLU值在100～1000范圍內(nèi)時(shí)視為要引以重視和注意，RLU值超過1000時(shí)視為處于微生物污染的危險(xiǎn)狀態(tài)，因此ATP 生物發(fā)光法十分適HACCP系統(tǒng)的清潔度檢測(cè)。此外，還可以用于酵母菌等對(duì)毒素的敏感性比較。近年來，ATP生物發(fā)光技術(shù)在國內(nèi)外倍受推崇，在美、日等國食品行業(yè)的質(zhì)量檢測(cè)控制領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，有效促進(jìn)食品生產(chǎn)企業(yè)提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益，隨著此方法不斷改進(jìn)和完善，生物發(fā)光法可望發(fā)展成為一種較為理想的微生物檢測(cè)方法而得到更廣泛的應(yīng)用，以不斷提高產(chǎn)品質(zhì)量，確保食品質(zhì)量安全。