李雪芳，戴絢麗

高效液相色譜法作為食品中防腐劑檢測的標準方法，廣泛地用于各種飲料，食品以及各種原輔料的質量控制中[1, 2, 3 ]。但是對于基質較為復雜的樣品，如醬油、醬包、桂圓肉、乳酸鏈球菌素等，我們以往的預處理方法是：對于醬包/濃縮汁，用水稀釋后，加熱超聲萃取，離心去除油層后上過濾，再進樣分析。對于醬油樣品，稀釋過濾后直接進樣分析。對于乳酸鏈球菌素，用水稀釋，超聲，離心過濾后進樣分析。該預處理方法簡單，但是由于樣品中存在色素，蛋白質，脂肪等多種干擾物質，上述預處理方法無法將干擾物質去除干凈，使得苯甲酸和山梨酸與存在的多種干擾物質在色譜柱很難分離，因此很難獲得滿意的檢測結果。同時，大量的雜質對色譜柱會造成污染，嚴重影響色譜柱的性能[4, 5]。為此我們根據(jù)苯甲酸和山梨酸在酸性條件下能同水蒸氣一起蒸餾出來的特點[6]，采用水蒸氣蒸餾法，用BUCHI 自動定氮儀對樣品進行預處理，探討了不同蒸餾條件下對檢測結果的影響，建立了一種對復雜基質食品中防腐劑適用的簡單、快捷的前處理方法。

1 實驗部分
1.1 試劑與儀器
1.1.1 主要試劑
甲醇，乙腈為色譜純
乙酸銨溶液(0.02mol/L)：稱取1.54g 乙酸銨(優(yōu)級純)，加水至1000ml，溶解，經(jīng)濾膜(0.45μm)
過濾。
苯甲酸標準工作液：將1mg/ml 苯甲酸儲備液稀釋1000 倍作為工作液。
山梨酸標準工作液：將1mg/ml 山梨酸儲備液稀釋1000 倍作為工作液。
1.1.2 主要儀器
Waters 高效液相色譜儀
BUCHI 自動蒸餾儀
1.2 色譜條件
色譜柱：Aglient Zorbax Eclipse XDB-C18 4.6x150mm；
流動相：乙酸銨溶液:甲醇=90:10 流速：1.0ml/min
檢測器：二極管陣列檢測器 進樣量：20μL
檢測波長： 苯甲酸230nm 山梨酸254nm
1.3 色譜條件
準確稱取10.00g 均勻樣品，置于蒸餾管內，加磷酸1ml，無水硫酸鈉20g，水15ml，在接受瓶中加入320μL1mol/L 氫氧化鈉，加入少量蒸餾水。BUCHI 自動蒸餾儀蒸餾強度100%蒸餾5min，收集餾出液，用水定容到200ml，餾份經(jīng)0.45μm 濾膜過濾后進樣。
1.4 定量方法
根據(jù)保留時間定性，外標峰面積法定量。

2 結果與分析
2.1 不同前處理方法檢測結果的比較
圖1(a)和1(b)為不同前處理方法對醬包樣品處理后所得的色譜圖。圖2(a)和1(b)為不同前處理方法對乳酸鏈球菌素樣品處理后所得的色譜圖。圖1(a)和圖2(a)的預處理方法為我們以往使用的預處理方法。圖1(b)和圖2(b)的預處理方法為本文提出的水蒸氣蒸餾法。從圖中可以看出，用以前的超聲萃取方法檢測醬包中的苯甲酸時，由于其基質復雜，干擾成分較多、黏度較高，造成了進樣后雜質峰過多，色譜峰分離度無法滿足要求，即使用200mm 色譜柱，用梯度洗脫，也無法將防腐劑與污染物質完全分離。而采用水蒸氣蒸餾處理后，樣品能完全被凈化，基本無基質干擾，因此用150mm 色譜柱，5min 內就可將苯甲酸和山梨酸完全分離，因此可以滿足大批量樣品的快速測定。另一方面，由于蒸餾后上機測試的樣品較干凈，因此在實際的分析測試中，可以加大進樣量，進一步降低方法的檢測限。

2.2 前處理條件的優(yōu)化
2.2.1 蒸餾強度的選擇
蒸餾強度對苯甲酸和山梨酸的蒸發(fā)程度存在一定影響，本實驗考察了不同蒸餾強度對苯甲酸和山梨酸回收率的影響，結果如表1。

隨著蒸餾強度的增大，苯甲酸和山梨酸的蒸出率不斷增大。因此，選擇選擇蒸餾強度100%。

2.2.2 無水硫酸鈉加入量的影響
加入無水硫酸鈉的目的是使樣品溶液的沸點升高，從而使苯甲酸和山梨酸盡可能蒸餾出來。加入不同量的無水硫酸鈉做加標回收試驗，結果見表2。

從上表可以看出，無水硫酸鈉的加入量對回收率有較大的影響，但當無水硫酸鈉的加入量達到20g 后，苯甲酸和山梨酸的回收率增加不明顯。 因此選擇無水硫酸鈉的加入量為20g。

2.2.3 磷酸加入量對回收率的影響
山梨酸和苯甲酸可能以山梨酸鹽和苯甲酸鹽的形式存在于樣品中,加入磷酸的目的是使樣品酸化，使防腐劑從鹽的形式完全轉化為酸的形式從而能隨水蒸氣蒸餾出來。考察了不同體積的磷酸加入量對結果的影響，結果見表3。

在實驗中發(fā)現(xiàn)，加入磷酸的量增加,山梨酸和苯甲酸的回收率增加,當加入磷酸量增加到1ml后，進一步增加酸度山梨酸和苯甲酸的回收率增加不明顯。

2.2.4 氫氧化鈉吸收液加入量的選擇
調節(jié)接受液的pH 值會影響苯甲酸和山梨酸的在水中的吸收效率。實驗考察了接受瓶中加入不同量1mol/L 氫氧化鈉溶液對苯甲酸和山梨酸回收率的影響，結果見表4。

隨著氫氧化鈉加入量的增加，吸收液的PH 升高，苯甲酸和山梨酸的吸收效率增加，當氫氧化鈉加入量到320 ul 時，回收率可達到要求，因此選擇加入1mol/L 氫氧化鈉320 ul。

2.3 方法的定量限，重現(xiàn)性及回收率考察
取樣品按本方法進行預處理后測定，以信躁比10，確定了該方法的定量限分別為苯甲酸0.035mg/L；山梨酸0.01mg/L。
對同一樣品按本方法平行測定6 次，測定結果如表5 所示。

從表中結果可以看出，采用該方法，苯甲酸和山梨酸測定的相對標準偏差均小于10%，這一結果說明了本方法具有很好的重現(xiàn)性，測定結果可靠。
用水蒸氣蒸餾法處理乳酸鏈球菌素，計算回收率，測定結果如表6 所示。


3 結論
本研究針對復雜樣品中防腐劑測定過程中存在的基質嚴重干擾的問題，采用在酸性條件下水蒸氣蒸餾法進行前處理，對樣品進行凈化，建立了高效液相色譜測定復雜基質樣品中防腐劑的方法。通過實驗確立了最佳的前處理條件以及色譜條件。該方法簡便、快速，且重現(xiàn)性好，回收率可達到80%以上，能夠用于日常分析檢測。