1.2.2.3.接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，23～28℃培養5～7天，加入3～5ml 0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，吸至無菌試管內，取1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10^-4~10^-6，制成每1ml含孢子數50～100cfu的孢子懸液。

1.2.3. 供試液的制備

1.2.3.1.無抑菌活性的供試品供試液的制備 

◆稀釋劑：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 

◆液體供試品：供試品10ml置錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，混勻，作為供試液（1：10）。

◆固體、半固體、粘稠性供試品供試品：稱取供試品10g置錐形瓶中，加稀釋劑至100ml，混勻后，作為供試液（1：10）。

1.2.3.2.具有抑菌活性的供試品供試液的制備

當供試品具有抑菌活性時，須先消除抑菌活性，其方法如下：

◆ 培養基稀釋法：取供試液2ml，每0.2ml的供試液注一皿或每0.1ml的供試液注一皿；或取供試液1ml每0.5ml的供試液注一皿，傾注15ml的培養基，測定細菌、霉菌及酵母菌的菌數，混勻，凝固，培養。每1ml供試液所注的平皿生長的菌數之和即為1ml的菌落數。計算每1ml供試液的平均菌落數，按平皿法計數規則報告菌數；控制菌檢查時可加大增菌液的用量。

◆離心沉淀集菌法：取一定量的供試液，3000轉/分離心20分鐘（供試液如有沉淀，先以500轉/分鐘離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補至原量。

◆薄膜過濾法：取規定量試驗可能用的稀釋級供試液，過濾，沖洗，按薄膜過濾法測定其菌落數。

◆ 中和法：選取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當的對氨基苯甲酸，含重金屬的藥物在培養基內加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉-半胱氨酸，洗必泰制劑加入聚山梨酸 80（3%）或卵磷脂（3%），鹵素中加入硫代硫酸鈉（0.1%）等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性后測定。

1.2.4. 菌液組 測定所加的試驗菌數。采用平皿法，取試驗用的1ml菌液（約50～100cfu）分別注入平皿中，立即傾入培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數。

1.2.5.試驗組

1.2.5.1.平皿法：取試驗可能用的稀釋級1ml供試液和50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數。 

1.2.5.2.培養基稀釋法（平皿法）：取試驗可能用的稀釋級1ml供試液分別注入N個平皿中，每個平皿再注入50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數。 

1.2.5.3薄膜過濾法：取規定量試驗可能用的稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌落數。至少要一張膜。 

1.2.5.4. 離心沉淀集菌法：取規定量試驗可能用的稀釋級供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉/分離心 20分鐘，取下面1ml液體，并用稀釋劑洗滌管底，將洗滌液與1ml液體一起采用平皿法或薄膜過濾法計數。  

1.2.6. 供試品對照組 

取規定量供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數（方法和試驗組相同）。

1.2.7.稀釋劑對照組

若供試液需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法等處理時，應增加稀釋劑對照組，用稀釋劑代替供試品，加入試驗菌，使最終濃度為每1ml 供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液制備方法和計數方法計數。

1.2.8.回收率計算 

1.2.8.1.試驗組回收率計算

試驗組的菌回收率＝ 試驗組的菌回收率—供試品對照組平均菌落數×100%菌液組的平均菌落數 

1.2.8.2. 稀釋劑對照組回收率計算 

試驗組的菌回收率＝ 稀釋劑對照組平均菌落數 ×100%菌液組的平均菌落數

計數方法驗證至少應進行3次獨立平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。

1.2.8.3. 結果判斷

在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率）≥70%。若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率）≥70%。照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應采用自然沉降法、培養基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證，使試驗組菌回收率大于70%。