制備單克隆抗體包括動物免疫、細胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產，要經過幾個月的一系列實驗步驟，下面按照制備單克隆抗體的流程順序，逐一介紹其實驗方法。

　　一、細胞融合前準備

　　一　免疫方案

　　選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質量的McAb至關重要。一般要在融合前兩個月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應根據抗原的特性不同而定。

　　1.　顆粒性抗原免疫性較強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細胞性抗原為例的免疫方案:

　　　　　　　　　　初次免疫　　　　　　　1×10７／0.5ml ip 腹腔內注射

　　　　　　　　　　　　↓　2～3周后

　　　　　　　　　　第二次免疫　　　　　　1×10７／0.5ml ip

　　　　　　　　　　　　↓　3周后

　　　　　　　　　　加強免疫融合前三天　1×10７／0.5ml ip或iv靜脈內注射

　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　取脾融合

　　2.　可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴散呈小滴狀表明已達到油包水的狀態。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。

　　　　　　初次免疫　 Ag　1～50μg　加福氏完全佐劑皮下多點注射

　　　　　　　　│　　　　　一般0.8～1ml　0.2ml／點

　　　　　　　　↓3周后

　　　　　　第二次免疫　劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip

　　　　　　　　│　　　　　　　ip劑量不宜超過0.5ml

　　　　　　　　↓3周后

　　　　　　　第三次免疫　劑量同上，不加佐劑，ip

　　　　　　　　│ 5～7天后采血測其效價，檢測免疫效果

　　　　　　　　↓2～3周后

　　　　　　加強免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv

　　　　　　　　↓3天后

　　　　　　　取脾融合

　　目前，用于可溶性抗原特別是一些弱抗原的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆�；�或固相化，一方面增強了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎免疫可直接采用脾內注射。③使用細胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應答水平，促進免疫細胞對抗原反應性。

　　二　飼養細胞

　　在制備單克隆抗體過程中，許多環節需要加飼養細胞，如：在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養過程中，加入飼養細胞是十分必要的。常用的飼養細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞較為常用、小鼠脾臟細胞或小鼠胸腺細胞，也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經放射線照射后作為飼養細胞，使用比較方便，照射后可放入液氮罐長期保存，隨用隨復蘇。

　　　　　小鼠腹腔巨噬細胞的制備

　　　　　小鼠采用與免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周齡

　　　　　　↓

　　　　　拉頸處死　浸泡于75％酒精，消毒3～5分鐘

　　　　　　↓

　　　　　用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜

　　　　　　↓

　　　　　用無菌注射器注入6～8ml培養液

　　　　　　↓

　　　　　反復沖洗，吸出沖洗液

　　　　　　↓

　　　　　放入10ml離心管，1200轉／分離心5～6分鐘

　　　　　　↓

　　　　　用20％小牛血清NCS或胎牛血清FCS的培養液混懸，調整細胞數1×10５／ml

　　　　　　↓

　　　　　加入96孔板，100μl／孔

　　　　　　↓

　　　　　放入37℃　CO2孵箱培養

　　一般飼養細胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得5～8×106腹腔巨噬細胞，若用小鼠胸腺細胞作為飼養細胞時，細胞濃度為5×106／ml，小鼠脾細胞為1×106／ml，小鼠的成纖維細胞3T31×105／ml，均為100μl／孔。

　　三　骨髓瘤細胞

　　骨髓瘤細胞系應和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細胞在同一品系小鼠腹腔內產生大量　McAb。

　　常用骨髓瘤細胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。

　　骨髓瘤細胞的培養適合于一般的培養液，如RPMI1640，DMEM培養基。小牛血清的濃度一般在10～20％，細胞的最大密度不得超10６／ml，一般擴大培養以1∶10稀釋傳代，每3～5天傳代一次。細胞的倍增時間為16～20小時，上述三株骨髓瘤細胞系均為懸浮或輕微貼壁生長，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細胞。

　　一般在準備融合前的兩周就應開始復蘇骨髓瘤細胞，為確保該細胞對HAT的敏感性，每3～6月應用8～AG8氮雜鳥嘌呤篩選一次，以防止細胞的突變。

　　保證骨髓瘤細胞處于對數生長期，良好的形態，活細胞計數高于95％，也是決定細胞融合的關鍵。

　　四　免疫脾細胞

　　免疫脾細胞指的是處于免疫狀態脾臟中B淋巴母細胞棗漿母細胞。一般取最后一次加強免疫3天以后的脾臟，制備成細胞懸液，由于此時B淋巴母細胞比例較大，融合的成功率較高。

　　脾細胞懸液的制備：在無菌條件下取出脾臟，用不完全的培養液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網上，用注射器針芯研磨成細胞懸液后計數。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的２倍，細胞數為２×10８左右。

　　二、細胞融合，選擇雜交瘤

　　一　細胞融合流程

　　1　取對數生長的骨髓瘤細胞SP2／0，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不完全培養液混懸細胞后計數，取所需的細胞數，用不完全培養液洗滌2次。

　　2　同時制備免疫脾細胞懸液，用不完全培養液洗滌2次。

　　3　將骨髓瘤細胞與脾細胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內用不完全培養液洗1次，1200rpm,8分鐘。

　　4　棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。

　　5　輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略加松動。

　　6　在室溫下融合:

　　①　30秒內加入預熱的1ml45％PEGMerek,分子量4000含5％DMSO，邊加邊攪拌。

　�、凇∽饔�90秒鐘，若冬天室溫較低時可延長至120秒鐘。

　�、邸〖宇A熱的不完全培養液，終止PEG作用，每隔２分鐘分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。

　　7　離心，800rpm，6分鐘。

　　8　棄上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細胞散開。

　　9　根據所用96孔培養板的數量，補加完全培養液，10ml一塊96孔板。

　　10 將融合后細胞懸液加入含有飼養細胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培養。

　　一般一塊96孔板含有1×107脾細胞。

　　二　HAT選擇雜交瘤

　　應用HAT 選擇培養液篩選雜交瘤細胞的原理已在研究生專題講座第六專題中已經提到，這里主要介紹加HAT選擇培養的時間和濃度。

　　一般在融合24小時后，加HAT選擇培養液。HT和HAT均有商品化試劑50×貯存，用時1ml加入50ml20％小牛血清完全培養液中。

　　因為在培養板內已加入飼養細胞、融合后的細胞，200μl／孔。所以在加選擇培養液時應加3倍量的HAT。我們認為，融合后最初補加的量可用全量的2／3進行選擇，可得到滿意的篩選結果。

　　50×HAT

　　H:　5×10-3M

　　A:　2×10-5M

　　T:　8×10-4M

　　一般選擇HAT選擇培養液維持培養兩周后，改用HT培養液，再維持培養兩周，改用一般培養液。

　　三、抗體的檢測

　　篩選雜交瘤細胞通過選擇性培養而獲得雜交細胞系中，僅少數能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細胞布滿孔底1／10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。

　　檢測抗體的方法應根據抗原的性質、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。

　　常用的方法有:

　　1.　ELISA用于可溶性抗原蛋白質、細胞和病毒等McAb的檢測。

　　2.　RIA用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。

　　3.　FACS熒光激活細胞分類儀用于檢查細胞表面抗原的McAb檢測。

　　4.　IFA用于細胞和病毒McAb的檢測。

　　上述方法均為一般實驗室的常規方法，故在此不介紹具體的實驗過程。

　　可靠的篩選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當貽誤整個篩選時機。

　　四、雜交瘤的克隆化和凍存

　　克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。犚r為經過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞；所需要的抗體特異性抗體分泌細胞和其它無關抗體分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開，就需要克隆化。克隆化的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆應盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產生抗體的能力。

　　一　克隆化方案

　　用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。

　　1.　有限稀釋法的程序

　　①　制備飼養細胞懸液同融合前準備

　�、凇￡栃钥准毎�的計數，并調細胞數在1～5×10３／ml

　�、邸∪�130個細胞放入6.5ml含飼養細胞完全培養液，即20個細胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排為每孔2個細胞。余下2.9ml細胞懸液補加2.9ml含飼養細胞的完全培養液,細胞數為10個／ml，100μl／孔加D、E、F三排，為每孔1個細胞。余下2.2ml細胞懸液補加2.2ml含飼養細胞的完全培養液，細胞數5個／ml，100μl／孔，加G、H兩排，為每孔0.5個細胞。

　　④　培養4～5天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆，補加完全培養液200μl／孔。

　　⑤　第8～9天時，肉眼可見細胞克隆，及時進行抗體檢測。

　　注:初次克隆化的雜交瘤細胞需要在完全培養液中加HT。

　　2.　軟瓊脂法

　　①　軟瓊脂的配制

　　含20％FCS小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640

　　1％瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預熱。

　　0.5％瓊脂：由1份1％瓊脂加1份含20％小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。

　　②　用上述0.5％瓊脂液含有飼養細胞15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。

　�、邸“�100／ml，500／ml或5000／ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。

　�、堋�1ml 0.5％瓊脂液42℃預熱在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。

　�、荨』靹蚝罅⒓磧A注于瓊脂基底層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。

　�、蕖�4～5天后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養細胞的24孔板中進行培養。

　　⑦　檢測抗體，擴大培養，必要時再克隆化。

　

　　二　雜交瘤細胞的凍存

　　及時凍存原始孔的雜交瘤細胞、每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養過程中隨時可能發生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則因為上述的意外而全功盡棄。

　　雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養環境不同而改變，在24孔培養板中培養，當長滿孔底時，一孔就可以凍一支安瓿。

　　細胞凍存液:

　　50％小牛血清

　　40％不完全培養液

　　10％　DMSO二甲亞砜

　　凍存液最好預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降到0℃，再降溫時一般按每分鐘降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中�；蚣毎�管降至0℃ 后放-70℃超低溫冰箱，次日轉入液氮中。也可以用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩定性，在液氮中細胞可保存數年或更長時間。

　　五、單克隆抗體的大量生產

　　大量生產單克隆抗體的方法主要有兩種：

　　1.　體外使用旋轉培養管大量培養雜交瘤細胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產量低，一般培養液含量為10～60μg／ml，如果大量生產，費用較高。

　　2.　體內接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。

　�、佟�實體瘤法　對數生長期的雜交瘤細胞按1～3×107／ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2 ml, 共2～4點。待腫瘤達到一定大小后一般10～20天則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達到1-10mg／ml。但采血量有限。

　�、凇「顾�的制備　常規是先腹腔注射0.5mlPristane降植烷或液體石臘于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天后可產生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復收集數次。腹水中單克隆抗體含量可達5-20mg/ml， 這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復蘇后轉種小鼠腹腔則產生腹水快、量多。

　　六、單克隆抗體的鑒定

　　對制備的McAb進行系統的鑒定是十分必要的。應對其做如下方面的鑒定:

　　1.　抗體特異性的鑒定：除用免疫原抗原進行抗體的檢測外，還應用與其抗原成分相關的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如①制備抗黑色素瘤細胞的McAb，除用黑色素瘤細胞反應外，還應用其它臟器的腫瘤細胞和正常細胞進行交叉反應，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關抗原的單克隆抗體。②　制備抗重組的細胞因子的單克隆抗體，應首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應，其次是與其它細胞因子間有無交叉。

　　2.　McAb的Ig類與亞類的鑒定：一般在用酶標或熒光素標記的第二抗體進行篩選時，已經基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標或熒光素標記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標準抗亞類血清系統作雙擴或夾心ELISA來確定McAb的亞類。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG3％，將有利于沉淀線的形成。

　　3.　McAb中和活性的鑒定：用動物的或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學活性。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。

　　4.　McAb識別抗原表位的鑒定：用競爭結合試驗、測相加指數的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。

　　5.　McAb親和力的鑒定：用ELISA或RIA競爭結合試驗來確定McAb與相應抗原結合的親和力。

　　七、影響因素、失敗原因分析

　　由于制備McAb的實驗周期長，環節多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。

　　其主要失敗原因和影響因素有:

　　1.　污染：包括細菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中最辣手的問題。一旦發現有霉菌污染就應及早將污染板棄之，以免污染整個培養環境。支原體的污染主要來源于牛血清，此外，其它添加劑、實驗室工作人員及環境也可能造成支原體污染。在有條件的實驗室，要對每一批小牛血清和長期傳代培養的細胞系進行支原體的檢查，查出污染源應及時采取措施處理。對于污染的雜交瘤細胞可以采取生物學的過濾方法，將污染的雜交瘤細胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待長出腹水或實體瘤時，犖^菌取出分離雜交瘤細胞，一般可除去支原體污染。

　　2.　融合后雜交瘤不生長：在保證融合技術沒有問題的前提下主要考慮下列因素①PEG有毒性或作用時間過長。②牛血清的質量太差，用前沒有進行嚴格的篩選。③骨髓瘤細胞污染了支原體。④HAT有問題，主要是A含量過高或HT含量不足。

　　3.　雜交瘤細胞不分泌抗體或停止分泌抗體

　�、佟∪诤虾笥屑毎�生長，但無抗體產生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細胞發生突變，變成A抵抗細胞所致。

　�、凇∮锌赡苁敲庖咴�抗原性弱，免疫效果不好。

　　③　對于原分泌抗體的雜交瘤細胞變為陰性，可能是細胞支原體污染，或非抗體分泌細胞克隆競爭性生長，從而抑制了抗體分泌細胞的生長。也可能發生染色體丟失。Goding91982曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。

　　三要:

　　要大量保持和補充液氮凍存的細胞原管。

　　要應用倒置顯微鏡經常檢查細胞的生長狀況。

　　要定期進行再克隆。

　　三不要:

　　不要讓細胞“過度生長”。因為非分泌的雜交瘤細胞將成為優勢，壓倒分泌抗體的雜交瘤細胞。

　　不要讓培養物不加檢查地任其連續培養幾周或幾個月。

　　不要不經克隆化而使雜交瘤在機體內以腫瘤生長形式連續傳好幾代。

　　4.　雜交瘤細胞難以克隆化

　　可能與小牛血清質量、雜交瘤細胞的活性狀態有關，或由于細胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化，應在培養液加HT。

 

 

抗體的制備方法與原理

一、抗血清的制備

　　有了質量好的抗原，還必須選擇適當的免疫途徑，才能產生質量好（特異性強和效價高）的抗體。

　�。ㄒ唬┯糜诿庖叩膭游�

　　作免疫用的動物有哺乳類和禽類，主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實驗室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。動物種類的選擇主要根據抗原的生物學特性和所要獲得抗血清數量，如一般制備抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因動物反應良好，而且能夠提供足夠數量的血清，用于免疫的動物應適齡，健壯，無感染性疾患，最好為///雄性，此外還需十分注意動物的飼養，以消除動物的個體差異以及在免疫過程中死亡的影響。若用兔，最好用純種新西蘭兔，一組三只，兔的體重以2～3kg為宜。

　　（二）免疫途徑

　　免疫途徑有多種多樣，如靜脈內、腹腔內、肌肉內、皮內、皮下、淋巴結內注射等，一般常用皮下或背部多點皮內注射，每點注射0.1ml左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。

　�。ㄈ�）佐劑

　　由于不同個體對同一抗原的反應性不同，而且不同抗原產生免疫反應的能力也有強有弱，因此常常在注射抗原的同時，加入能增強抗原的抗原性物質，以刺激機體產生較強的免疫反應，這種物質稱為免疫佐劑。

　　佐劑除了延長抗原在體內的存留時間，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激網狀內皮系統，使參與免疫反應的免疫活性細胞增多，促進T細胞與B細胞的相互作用，從而增強機體對抗原的細胞免疫和抗體的產生。

　　常用的佐劑是福氏佐劑（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例，視需要可調整為1：2～9（V/V），這是不完全福氏佐劑，在每毫升不完全佐劑加入1～20mg卡介苗就成為完全佐劑。

　　配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4℃下保存備用。免疫前取等容積完全或不完全佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再繼續研磨成乳劑，滴于冰水上5～10min內完全不擴散為止。為避免損失抗原，亦可用一注射器裝抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復抽吸，約數十分鐘后即能完全乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。

　�。ㄋ模┟庖叻椒�

　　抗原劑量，首次劑量為300～500μg，加強免疫的劑量約為首次劑量為1/4左右。每2～3周加強免疫一次。加強免疫時用不完全佐劑，首次免疫時皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加強免疫時不必注射百日咳疫苗。

　　在第2次加強免疫后2周，從耳緣靜脈取2～3ml血，制備血清，檢測抗體效價（見后）。如未達到預期效價，需再進行加強免疫，直到滿意時為止（圖2-3）。當抗體效價達到預期水平時，即可放血制備抗血清。

 

圖2-3 抗體反應

　　（五）抗血清的采集與保存

　　家兔是最常用以產生抗體的動物，因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動物以頸靜脈、動脈取血，鼠等小動物取血可參閱有關資料。取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動脈放血，一是頸動脈入血，也可心臟采血。取動脈或靜脈放血時，將兔放入一個特造的木匣或籠內，耳露于箱（籠）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管擴張、充血。用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術刀片，快速切開動脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30～40ml 。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反復多次放血。頸動脈放血時，將兔仰臥，固定于兔臺，剪去頸部的毛，切開皮膚，暴露頸動脈，插管，放血。放血過程中要嚴格按無菌要求進行。

　　收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4℃下，過夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10min。在無菌條件，吸出血清，分裝（0.05～0.2ml），貯于-40℃以下冰箱，或凍干后貯存于4。C冰箱保存。

　　（六）抗血清質量的評價

　　在免疫期間，不僅各個不同的動物，而且同一動物在不同的時間內抗血清效價、特異性、親合力等都可能發生變化，因而必須經常地采血測試。只有在對抗血清的效價、特異性、親合力等方面作徹底的評價后，才可使用所取得的抗血清。

　　1．效價 　抗血清的效價，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價測定的方法常用的是放射免疫法，此法對所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產生的抗體，可用雙擴散等方法測定。前者測定的效價極為精確。而后者則粗糙得多。

　�。�1）放射免疫法： 以不同稀釋度的抗血清與優質標記抗原混合，孵育24h后，測定其結合率。通常以結合率為50%的血清稀度和為效價。如某抗血清的結合率為50%時的稀釋度為1：15000，則該血清的效價就是1：15000�？寡�清的效價，除由抗血清本身的性質決定外，還受標記抗原的質量、孵育時間，所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響，在工作中必須引起注意。（測定方法見第8章�。�

　　（2）雙向擴散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴散，兩者在相交處產生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。

　　球脂板的制備：100ml pH7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65℃左右時，加入疊氮鈉（NaN3），使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，完全凝固后，用打孔器打孔（圖2-4）。中央孔內加適量抗原（容量為50μl），周圍各孔內分別加入50μl 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h，觀察有無沉淀線產生，以判斷血清的稀釋度（圖2-5）。

 

圖2-4 雙向擴散模型

 

圖2-5 免疫擴散試驗

　　2．特異性測定 　　抗血清的特異性或稱專一性是指抗血清對相應的抗原及近似的抗原物質的識別能力。特異性好就是抗血清的識別能力強。通常，特異性是以交叉反應率來表示的。交叉反應率低，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差。交叉反應率一般是用競爭抑制曲線來判斷的。以不同濃度的抗原和近似抗原物質分別做競爭抑制曲線，計算各自的結合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50時的濃度，按下列公式計算交叉反應率。

　　S=y/Z×100%

　　S：交叉反應率，y：IC50時抗原濃度，Z：IC50時近似抗原物質的濃度。

　　如某抗原的IC50濃度為90Pg/管，而一些近似抗原物質IC50濃度幾乎是無限大，可以說這一抗血清與其它抗原物質的交叉反應率近似零，即無交叉反應，該抗血清的特異性是好的。

　　3．親合力 　　在免疫學中， 親合力是指抗體與結合抗原體的活度或牢固度�？贵w與抗原結合疏松，結合后會迅速解離，稱為親合力低，反之，親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小，抗體分子的結合位點與抗原的決定基之間的立體結構型的合適程度決定的。親合力常以親合常數K表示。K的單位是升/摩爾（L/mol）。在RIA中，K是該抗血清能達到的最小檢出量（靈敏度）的倒數，K=1/[H]，[H]是最小檢出量，通常，K的范圍在108～1012L/mol之間，也有高達1014L/mol的。

　　計算親合常數的方法20余種，計算出的K都不能真實反映實驗情況，只能作為參考。

　�。ㄆ撸┟庖呤�敗的可能原因及應采取的措施

　　有時不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進之。

　�。�1）免疫動物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動物的種屬或品系，或擴大免疫動物的數量。

　�。�2）抗原質量是否良好，可改用其它廠家的產品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮改變抗原分子的部分結構，或改進提取方法。

　�。�3）制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯劑，載體、抗原或載體的比例、反應時間等多方面去考慮，并加以改進。

　�。�4）所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強乳化。

　�。�5）免疫的方法、劑量，加強免疫的間隔時間和次數，免疫的途徑是否合適。

　�。�6）動物的飼養是否得當，如營養（飼料、飲水）、環境衛生（通風、采光、溫度）是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。

　　二、單克隆抗體的制備

　　1975年Kohler和Milstein發現將小鼠骨髓瘤細胞與和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交瘤細胞既可產生抗體，又可無性繁殖，從而創立了單克隆抗體雜交瘤技術。這一技術上的突破使血清學的研究進入了一個高度精確的新紀元。

　　免疫細胞化學的 技術關鍵之一是制備特異性強、親合力大、滴度高的特異性抗體，由于每種抗原都有幾個抗原決定簇，用它免疫動物將產生對各個決定簇的抗體，即多克隆抗體。單克隆抗體則是由一個產生抗體的細胞與一個骨髓瘤細胞融合而形成的雜交廇細胞經無性繁殖而來的細胞群所產生的，所以它的免疫球蛋白屬同一類型，質地純一，而且它是針對某一抗原決定簇的，因此特異性強，親合性也一致。單克隆抗體（McAb）的特性和常規血清抗體的特性比較見2-3。

表2—3 單克隆抗體（McAb）和常規免疫血清抗體的特性比較

　　單克隆抗體的制備方法如下。

　　（一）動物的選擇與免疫

　　1．動物的選擇 　純種BALB/C小鼠，較溫順，離窩的活動范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環境潔凈的實驗室均能飼養成活。目前開展雜交瘤技術的實驗室多選用純種BALA/C小鼠。

　　2．免疫方案 　　選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質量的McAb至關重要。一般在融合前兩個月左右根據確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應根據抗原的特性不同而定。

　　（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。

　　初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點注射或脾內注射（一般0.8～1ml,0.2ml/點）

　　↓3周后

　　第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內注射）（ip劑量不宜超過0.5ml）

　　↓3周后

　　第三次免疫 劑量同一，不加佐劑，ip（5～7天后采血測其效價）

　　↓2～3周

　　加強免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv（靜脈內注射）

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：①將可溶性抗原顆�；�或固相化，一方面增強了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎免疫可直接采用脾內注射。③使用細胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應答水平，增強免疫細胞對抗原的反應性。

　�。�2）顆粒抗原免疫性強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為1～2×107個細胞。

　　初次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓2～3周后

　　第二次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓3周后

　　加強免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv

　　↓

　　取脾融合

　�。ǘ�）細胞融合

　　1．細胞融合前準備

　�。�1）骨髓瘤細胞系的選擇：骨髓瘤細胞應和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內產生大量McAb。常用的骨髓瘤細胞系見表2-4。

表2-4用于融合試驗的主要骨髓瘤細胞系

　　骨髓瘤細胞的培養可用一般的培養液，如RPMI1640，DMEM培養基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細胞濃度以104～5×105/ml為宜，最大濃度不得超過106/ml。當細胞處于對數生長的中期時，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細胞在傳代過程中，部分細胞可能有返祖現象，應定期用8-氮鳥嘌呤進行處理，使生存的細胞對HAT呈均一的敏感性。

　�。�2）飼養細胞：在組織培養中，單個或少數分散的細胞不易生長繁殖，若加入其它活細胞，則可促進這些細胞生長繁殖，所加入的這種細胞數被稱為飼養細胞。在制備McAb的過程中，許多環節　需要加飼養細胞，如在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養過程中，加入飼養細胞是十分必要的。常用的飼養細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經放射線照射后作為飼養細胞。飼養細胞的量為一般為2×104或105細胞/孔。

　　2．細胞融合的步驟

　�。�1）制備飼養細胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細胞。

　　與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周

↓

　　拉頸 處死，浸泡在75%酒精內，3～5min

　　↓

　　用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜

　　↓

　　用無菌注射器注入5～6ml預冷的培養液（嚴禁刺破腸管）

　　↓

　　反復沖洗，吸出沖洗液

　　↓

　　沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離5～6min

　　↓

　　用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養液混懸，調整細胞數至1×105/ml

　　↓

　　加入96孔板，100μl/孔

　　↓

　　放入37。c CO2孵箱培養

　�。�2）制備免疫脾細胞

　　最后一次加強免疫3天后小鼠拉頸處死

　　↓

　　無菌取脾臟，培養液洗 一次

　　↓

　　脾臟研碎，過不銹鋼篩網

　　↓

　　離心，細胞用培養液洗2次

　　↓

　　計數

　　↓

　　取108脾淋巴細胞懸液備用

　�。�3）制備骨髓瘤細胞

　　取對數生長骨髓瘤細胞離心

　　↓

　　用無血清培養液洗2次

　　↓

　　計數，取得×107細胞備用

　　（4）融合

　�、賹⒐撬枇黾毎�與脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。

　�、�90s內加入37℃預溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。

　　③加37。C預溫的不完全培養液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

　�、茈x心，800rpm, 6min。

　�、莩渖锨�，用含20%小牛血清HAT選擇培養液重懸。

　�、迣⑸鲜黾毎�，加到已有飼養細胞層的96孔板內，每孔加100μl。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。

　　⑦將培養板置37℃、5%CO2培養箱中培養。

　�。ㄈ�）選擇雜交瘤細胞及抗體檢測

　　1．HAT選擇雜交瘤細胞　　　脾細胞和骨髓瘤細胞經PEG處理后，形成多種細胞的混合體，只有脾細胞與骨髓細胞形成的雜交瘤細胞才有意義。在HAT選擇培養液中培養時，由于骨髓瘤細胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養液可以生長繁殖。

　　在用HAT選擇培養1～2天內，將有大量瘤細胞死亡，3～4天后瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落，HAT選擇培養液維持7～10天后應換用HT培養液，再維持2周，改用一般培養液。在上述選擇培養期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。在選擇培養期間，一般每2～3天換一半培養液。

　　2．抗體的檢測　　 檢測抗體的方法應根據抗原的性質、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。

　　常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。（2）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）可用于可溶性抗原、細胞和病毒等McAb的檢測。（3）免疫熒光試驗適合于細胞表面抗原的McAb的檢測。（4）其它如間接血凝試驗、細胞毒性試驗、旋轉粘附雙層吸附試驗等。

　�。ㄋ模╇s交瘤的克隆化

　　雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。因為經過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細胞和其它無關抗體的分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開就需要克隆化�？寺』�的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產生抗體的能力。

　　克隆化的方法很多，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。

　　1．有限稀釋法克隆

　�。�1）克隆前1天制備飼養細胞層（同細胞融合）。

　　2）將要克隆的雜交瘤細胞從培養孔內輕輕吹干，計數。

　�。�3）調整細胞為3～10個細胞/ml。

　　（4）取頭天準備的飼養細胞層的細胞培養板，每孔加入稀釋細胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

　　（5）在第7天換液，以后每2～3天換液1次。

　�。�6）8～9天可見 細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。

　�。�7）將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養。

　�。�8）每個克隆應盡快凍存。

　　2．軟瓊脂培養法克隆

　�。�1）軟瓊脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。

　　①1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預熱。

　�、�0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。

　�。�2）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養細胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。

　�。�3）按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。

　　（4）1ml 0.5%瓊脂液（42℃預熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。

　�。�5）混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

　　（6）4～5天 后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養細胞的24孔中進行培養。

　　（7）檢測抗體，擴大培養，必要是地再克隆化。

　　（五）雜交瘤細胞的凍存與復蘇

　　1．雜交瘤細胞的凍存　　 及時凍存原始孔的雜交瘤細胞每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養過程中隨時可能發生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。

　　雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養環境不同而改變，在24孔培養板中培養，當長滿孔底時，一孔就可以裝一支安瓿凍存。

　　細胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養液；10%DMSO（二甲基亞砜）。

　　凍存液最好預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降至0℃后放入-70℃超低溫冰箱，次日轉入液氮中。也可用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩定性，在液氮中細胞可保存數年或更長時間。

　　2．細胞復蘇方法 　將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min內使凍存的細胞解凍，將細胞用完全培養液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的飼養層細胞的培養瓶內，置37℃、5%CO2孵箱中培養，當細胞形成集落時，檢測抗體活性。

　　（六）單克隆抗體的大量生產

　　大量生產單克隆抗體的方法主要有兩種：

　�。�1）體外使用旋轉培養管大量培養雜交瘤細胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產量低，一般培養液內抗體含量為10～60μg/ml,如果大量生產，費用較高。

　　（2）體內接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。

　�、賹嶓w瘤法：對數生長期的雜交瘤細胞按1～3×107/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml,共2～4點。待腫瘤達到一定大小后（一般10～20天）則可采血，從血清中獲得單克隆 抗體的含量可達到1～10mg/ml。但采血量有限。

　　②腹水的制備：常規是先腹腔注射0.5ml Pristane 降植烷或液體石蠟于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天后可產生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反復收集數次。腹水中單克隆抗體含量可達到5～10mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復蘇后轉種小鼠腹腔則產生腹水塊、量多。

　�。ㄆ撸﹩慰寺】贵w的鑒定

　　對制備的McAb進行系統的鑒定是十分必要的，應做下述幾個方面的鑒定：

　　1．抗體特異性的鑒定 　　除用免疫原（抗原）進行抗體的檢測外，還應該用與其抗原成分相關的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如：①制備抗黑色素瘤細胞的McAb，除用黑色素瘤細胞反應外，還應該用其它臟器的腫瘤細胞和正常細胞進行交叉反應，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關抗原的單克隆抗體。②制備抗重組的細胞因子的單克隆抗體，應首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應，其次是與其它細胞因子間有無交叉。

　　2．McAb的Ig類與亞類的鑒定　　一般在用酶標或熒光素標記的第二抗體進行篩選時已經基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標或熒光素標記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標準抗亞類血清系統作雙擴或夾心ELISA來確定。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG（3%），更有利于沉淀線的形成。

　　3．McAb中和活性的鑒定　　　用動物或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學活性。例如，如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。

　　4．McAb識別抗原表位的鑒定　　用競爭結合試驗，測相加指數的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。

5．McAb親合力的鑒定　 用ELISA或RIA競爭結合試驗來確定McAb與相應抗原結合的親合力。

 

ELISA

ELISA是酶聯接免疫吸附劑測定 Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay 的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術之后發展起來的一種免疫酶技術。此項技術自70年代初問世以來，發展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學和醫學科學的許多領域。

　　一　原理

　　ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、牽9體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由于抗原、抗體的反應在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩定性。在實際應用中，通過不同的設計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法圖a、用于檢測抗原的雙抗體夾心法圖b以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。

　　二　操作步驟

　　方法一　用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:

　　1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。簡稱洗滌，下同。

　　2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔。

　　3.　加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體經滴定后的稀釋度0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。

　　4.　加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。

　　5.　終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6.　結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm若以ABTS顯色，則410nm處，以空白對照孔調零后測各孔O·D值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

　　方法二　用于檢測未知抗體的間接法：

　　　　　　用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，
每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　加一定稀釋的待檢樣品未知抗體0.1ml于上述已包被之反應孔
中,置37℃孵育1小時,洗滌。同時做空白、陰性及陽性孔對照

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體抗抗體0.1ml，
37℃孵育30-60分鐘，洗滌,最后一遍用DDW洗滌。

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

　　三　試劑器材

　　1.　試劑

　　1　包被緩沖液PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液:

　　　　　　Na?CO３　　　　1.59克

　　　　　　NaHCO３　 2.93克

　　　　　　加蒸餾水至1000ml

　　2　洗滌緩沖液PH7.4 PBS：0.15M

　　　　　　KH2PO4 　　　　　0.2克

　　　　　　Na2HPO４·12H2O　　2.9克

　　　　　　NaCl　　　　　　　8.0克

　　　　　　KCl　　　　　　　　0.2克

　　　　　　Tween-20　0.05％　0.5ml

　　　　　　加蒸餾水至1000ml

　　3　稀釋液：

　　　　　　　牛血清白蛋白BSA 0.1克

2.　器材:

　　1　聚苯乙烯塑料板簡稱酶標板40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

　　2　小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

　　3　4℃冰箱，37℃孵育箱。

　　四　注意事項

　　1.　正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

　　2.　在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:

　　1　固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。

　�。�2 包被抗體或抗原的選擇：將抗體或抗原吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質包被的最適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度0.1、1.0和10μg／ml等進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對于多數蛋白質來說通常為1～10μg／ml。

　　3　酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定見酶標記抗體部份。然后再固定其它條件或采取“方陣法”包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度在正式實驗系統里準確地滴定其工作濃度。

4   酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體如OPD等有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

 

 

免疫組化染色方法

 

SP法
1）脫蠟、水化；
2）PBS洗2～3次各5分鐘；
3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；
4）PBS洗2～3次各5分鐘； 5）抗原修復；
6）PBS洗2～3次各5分鐘；
7）滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。
8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。
9）4℃過夜后需在37℃復溫45分鐘。
10）PBS洗3次各5分鐘；
11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時；
12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
13）PBS洗3次各5分鐘；
14）DAB顯色5～10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；
15）PBS或自來水沖洗10分鐘；
16）蘇木精復染2分鐘，鹽酸酒精分化；
17）自來水沖洗10～15分鐘；
18）脫水、透明、封片、鏡檢。

 

SABC法
1脫蠟、水化。
2PBS洗兩次各5分鐘。
3用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鐘，蒸餾水洗3次。
4抗原修復。
5PBS洗5分鐘。 
6滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。
7滴加Ⅰ抗,室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時（4℃過夜后在37℃復溫45分鐘）。
8PBS洗三次每次2分鐘。
9滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分鐘。
10PBC洗3次每次2分鐘。
11滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鐘。

12PBS洗4次每次5分鐘。
13DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。
14蒸餾水洗。蘇木素復染2分鐘、鹽酸酒精分化。 
15脫水、透明、封片、鏡檢。

 

 

常用抗原修復方法

 

用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織切片：

 

1）抗原熱修復  可根據實驗室的具體條件，選用微波爐抗原修復、高壓鍋抗原修復或水浴高溫抗原修復�？乖瓱嵝迯涂蛇x用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實驗證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。請選用我公司提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液（粉劑）配制，取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH值在6.0 ± 0.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請自行調整。
（1）高壓熱修復  切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0，工作液）或0.001M EDTA（pH8.0）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當壓力鍋開始慢慢噴氣時（約加熱5~6分鐘后），計時1~2分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。

（2）煮沸熱修復  切片脫蠟至水后，放入盛有0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0，工作液）的容器中，并將此容器置于盛有一定數量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達92℃~98℃起開始計時15~20分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻20~30分鐘，蒸餾水沖洗，PBS洗，

（3）微波熱修復。切片脫蠟至水后，3％H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續10~15分鐘（注意：無論是使用醫用或家用微波爐，請根據具體機型酌情設置條件，務必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求）。取出容器，室溫冷卻10~20分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復原有的空間構型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。

2）酶消化方法  常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱至37℃，切片也預熱至37℃，消化時間約為5~30分鐘（胰酶的最終濃度可以根據使用者的要求進行調整，濃度范圍可以從0.05%至0.25%）； 胃蛋白酶消化37℃時間為30分鐘。皂素（Saponin）：一般使用濃度為2~10mg/ml的saponin溶液，消化時間為室溫孵育30分鐘。 適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。