（2）制備PAP復(fù)合物：離體條件下，使兔抗HRP抗體與HRP形成可溶性復(fù)合物。在制備抗HRP血清時，HRP的純度要高（RZ≥3），而制備PAP復(fù)合物時，HRP的質(zhì)量要求不高，甚至可用酶的粗制品。主要步驟如下：

①取HRP血清，力D 7．6ml含7．6mgHRP（1。0mg／m1）的水溶液。

②混勻，室溫1h后，4℃環(huán)境下離心16 000r 15min。

③0．9％NaCI（冷鹽水）溶解沉淀，4℃環(huán)境下離心16 000r15min，重復(fù)4次。

④加15．3ml HRP水溶液，在室溫下持續(xù)攪拌。

⑤用lmol／L及0．1mol／l HCl調(diào)pH至2．3，當(dāng)沉淀物全部溶解變清，立即用lmol／L NaOH調(diào)pH至7．2[1N怨（mol／L×離子價數(shù)）]。

⑥慢慢加入等體積的飽和硫酸銨，0℃環(huán)境下放置45min。

⑦離心35 000r 0℃15min，沉淀用50％硫酸銨漂洗兩次。

⑧用10．5ml水溶解沉淀，對透析液[48．6g NaCl，1．5mol／I。NaOOCCH，30ml，3mol／L（NH+）2804 30ml，水5．94L]透析，4℃環(huán)境下離心，收集上清液，加透析液使體積至10．5ml，分裝低溫保存。

（3）PAP復(fù)合物的質(zhì)量鑒定：制備的PAP復(fù)合物應(yīng)檢測酶和抗體的含量，以鑒定PAP復(fù)合物的質(zhì)量。常用分光光度計檢測PAP的復(fù)合物在280nm（1gG的最大吸收波長）和400nm（HRP的最大吸收波長）的光密度值（OD值），按下式計算IgG和HRP的含量。

一般HRP／抗HRP的克分子比達(dá)1．9時，可分裝冷藏于一85’C冰箱。由于稀釋后的PAP復(fù)合物不穩(wěn)定，4℃環(huán)境下只能保存2～3周。因此，最好臨用前配制。

（4）PAP復(fù)合物的特征：PAP復(fù)合物的形成不同于其他抗原抗體反應(yīng)，在抗原稍過量時，所有的抗HRP抗體均參與形成可溶性PAP復(fù)合物，僅殘留少許游離的HRP，而大多數(shù)抗原抗體反應(yīng)需要抗原絕對過量才能形成可溶性復(fù)合物。PAP復(fù)合物的形狀相當(dāng)穩(wěn)定，不受抗原量的影響，無論最初加入的抗原抗體過量與否，最終形成的PAP復(fù)合物其HRP與抗HRP之比絕大部分為3；2。應(yīng)用離心沉降、液相擴(kuò)散等方法分析表明：PAP復(fù)合物沉降系數(shù)為11．5s，分子量為400—430kD，由此可推算出酶與抗體之比為3：2，即每個PAP生命物由3個HRP分子和2個抗HRP抗體組成，呈五角形結(jié)構(gòu)，3個角為HRP，另兩個角為抗HRP抗體。采用H2O2—DAB染色，電子顯微鏡下已經(jīng)觀察到PAP復(fù)合物五角形環(huán)狀結(jié)構(gòu)，直徑平均21nm。這種結(jié)構(gòu)異常穩(wěn)定。據(jù)報道PAP復(fù)合物的抗HRP抗體與HRP結(jié)合常數(shù)為108，在此可溶性復(fù)合物中，即使存在少量游離HRP，亦不影響其穩(wěn)定性。

（5）PAP染色原理：與酶橋法相似，都是借助橋抗體將酶連結(jié)在與組織抗原結(jié)合的第1抗體上，所不同的是PAP法將酶橋法的步驟3和步驟4合并為一步，用PAP復(fù)合物代替，即第3步用PAP復(fù)合物孵育切片，故稱PAP法。PAP復(fù)合物中的抗HRP抗體和第1抗體為相同種屬動物的IgG，所以橋抗體能夠作為“橋”將PAP復(fù)合物連結(jié)在第1抗體上。

（6）PAP染色步驟：主要步驟與酶橋法相似。

PAP法主要染色步驟

①切片準(zhǔn)備及第1抗體孵育前處理同間接法；切片與特異性第1抗體孵育同酶橋法。

②用過量的橋抗體孵育，作用同酶橋法。

③用離體制得的PAP復(fù)合物（1：30～300稀釋）孵育1～1．5h（室溫），使其被橋抗體連結(jié)在第1抗體上。亦可用ALP抗ALP復(fù)合物代替。

④顯色觀察同間接法。