—免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法

 

1 范圍

     本標準規定了免疫親和層析凈化—高效液相色譜法和免疫親和層析凈化—熒光光度法測定食品中黃曲霉毒素的條件和詳細分析步驟。

本標準適用于玉米、花生及其制品（花生醬、花生仁、花生米）、大米、小麥、植物油脂、醬油、食醋等食品中黃曲霉毒素的測定。

樣品中黃曲霉毒素的檢出限：免疫親和層析凈化—高效液相色譜法和免疫親和層析凈化—熒光光度法為1mg/kg；免疫親和層析凈化—熒光光度法測定醬油樣品中黃曲霉毒素檢出限為2.5mg/kg。

 

2 免疫親和層析凈化高效液相色譜法

2.1 方法提要

    試樣經過甲醇-水提取，提取液經過濾、稀釋后，濾液經過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有專一性，黃曲霉毒素交聯在層析介質中的抗體上。用水或吐溫/PBS將免疫親和柱上雜質除去，以甲醇通過免疫親和層析柱洗脫，洗脫液通過帶熒光檢測器的高效液相色譜儀柱后碘溶液衍生測定黃曲霉毒素的含量。

 

2.2 試劑和溶液

    除非另有規定，僅使用分析純試劑、重蒸餾水。

2.2.1甲醇（CH3OH）：色譜純

2.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水

2.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水

2.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水

2.2.5 苯：色譜純

2.2.6乙腈：色譜純

2.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯

2.2.8氯化鈉（NaCl）

2.2.9磷酸氫二鈉（Na2HPO4）

2.2.10磷酸二氫鉀（KH2PO4）

GB/T 18979-2003

 

2.2.11氯化鉀（KCl）

2.2.12  PBS緩沖溶液：稱取8.0g氯化鈉，1.2g磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，用990mL純水溶解，然后用濃鹽酸調節pH值至7.0，最后用純水稀釋至1000mL。

2.2.13  吐溫-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐溫-20，加入PBS緩沖溶液并定容至1000mL。

2.2.14  pH7.0磷酸鹽緩沖溶液：取25.0mL 0.2mol/L的磷酸二氫鉀溶液與29.1mL 0.1mol/L的氫氧化鈉溶液混勻后，稀釋到100 mL。

2.2.15 黃曲霉毒素標準品（黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2）：純度≥99%。

2.2.16 黃曲霉毒素標準貯備溶液：用苯-乙腈（98+2）溶液分別配制0.100mg/mL的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標準貯備液，保存于4ºC備用。

2.2.17 黃曲霉毒素混合標準工作液：準確移取適量的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標準貯備液，用苯-乙腈（98+2）溶液稀釋成混合標準工作液。

2.2.18 柱后衍生溶液（0.05%碘溶液）：稱取0.1g碘，溶解于20mL甲醇后，加純水定容至200mL，以0.45μm的尼龍濾膜過濾，4℃避光保存。

 

2.3 儀器和設備

    實驗室常規儀器、設備、材料及下列各項。

2.3.1 高速均質器：18,000 r/min ~22,000 r/min。

2.3.2 黃曲霉毒素免疫親和柱。

2.3.3 玻璃纖維濾紙：直徑11cm，孔徑1.5μm。

2.3.4 玻璃注射器：10 mL，20mL。

2.3.5 玻璃試管：直徑12 mm ，長75mm，無熒光特性。

2.3.6 高效液相色譜儀：具有360nm激發波長和大于420nm發射波長的熒光檢測器。

2.3.7 空氣壓力泵。

2.3.8 微量注射器：100mL。

2.3.9 色譜柱：C18柱（柱長150 mm ，內徑4.6mm，填料直徑5mm）。

 

2.4 分析步驟

2.4.1提取

2.4.1.1大米、玉米、小麥、花生及其制品：準確稱取經過磨細（粒度小于2mm）的試樣25.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及準確加入125.0mL（ ）甲醇-水（7+3），以均質器高速攪拌提取2min。定量濾紙過濾，準確移取15.0mL（ ）濾液并加入30.0mL（ ）水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1~2次，至濾液澄清，備用。

2.4.1.2 植物油脂：準確稱取試樣25.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及加入甲醇-水（7+3）至125.0mL（ ），以均質器高速攪拌提取2min。定量濾紙過濾，準確移取15.0mL（ ）濾液并加入30.0mL（ ）水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1~2次，至濾液澄清，備用。

2.4.1.3 醬油：稱取試樣50.0g于250.0mL具塞錐形瓶中，加入2.5g氯化鈉及加入甲醇-水（8+2）至100.0mL（ ），以均質器高速攪拌提取1min。定量濾紙過濾，準確移取10.0mL（ ）濾液并加入40.0mL（ ）水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1~2次，至濾液澄清，備用。

2.4.1.4 食醋：準確稱取5.0g樣品，加入1.0g氯化鈉，以pH7.0磷酸鹽緩沖溶液稀釋至25.0mL（ ），混勻，定量濾紙過濾。取10.0mL（ ）濾液加入10.0mL（ ）緩沖液，混勻。以玻璃纖維濾紙過濾1~2 次，至濾液澄清，備用。

2.4.2 凈化

2.4.2.1 大米、玉米、小麥、花生及其制品、植物油脂： 將免疫親和柱連接于20.0mL玻璃注射器下。準確移取15.0mL（ ）樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體。以10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體。準確加入1.0mL（ ）色譜級甲醇洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

2.4.2.2 醬油： 將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準確移取10mL（ ）醬油樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過免疫親和柱。用10.0mL 0.1%的吐溫/PBS清洗，再以10.0mL水清洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2 mL~3mL空氣通過柱體。準確加入1.0mL（ ）色譜級甲醇洗脫，流速為1mL/min~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

2.4.2.3食醋： 將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準確移取10.0mL（ ）食醋樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，用10mL 0.1%的吐溫/PBS溶液清洗，再以10.0mL水清洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2 mL~3mL空氣通過柱體。準確加入1.0mL（ ）色譜級甲醇洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

2.4.3測定

2.4.3.1    高效液相色譜條件

流動相：甲醇-水（45+55）

流速：0.8mL/min

柱后衍生化系統

衍生溶液：0.05%碘溶液

衍生溶液流速：0.2mL/min

反應管溫度：70°C

反應時間：1min

2.4.3.2    定量

用進樣器吸取100mL黃曲霉毒素標準工作液（2.2.17）注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定標準溶液的響應值（峰高或峰面積），得到黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標準溶液高效液相色譜圖。參考譜圖見圖1。

   

 

 

圖1  黃曲霉毒素B1, B2, G1, G2的標準譜圖

 

取樣品洗脫液1.0mL加入重蒸餾水定容至2.0mL，用進樣器吸取100mL注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定試樣的響應值（峰高或峰面積）。經過與黃曲霉毒素標準液譜圖比較響應值得到試樣中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2的濃度 。

2.4.4 空白試驗

    用水代替試樣，按2.4.1~2.4.3步驟做空白試驗。

2.4.5 結果計算

檢測結果按公式（1）計算：

                        …………（1）

      

式中： — 試樣中黃曲霉毒素（B1、B2、G1或G2）的含量，mg/kg；

      — 試樣中黃曲霉毒素B1、B2、G1或G2的含量，mg/L；

      — 空白試驗黃曲霉毒素B1、B2、G1或G2的含量，mg/L；

      — 最終甲醇洗脫液體積，mL；

      — 最終凈化洗脫液所含的試樣質量，g；

      — 試樣稱取量，g；

      — 樣品和提取液總體積，mL；

      — 稀釋用樣品濾液體積，mL；

      — 稀釋液體積，mL；

      — 通過親和柱的樣品提取液體積，mL。

    黃曲霉毒素總量為B1、B2、G1、G2個別濃度之和，即B1+B2+G1+G2。

注：計算結果需扣除空白值。

計算結果表示到小數點后2位。

 

3 免疫親和層析凈化熒光光度法

3.1 方法提要

試樣經過甲醇-水提取，提取液經過濾、稀釋后，濾液經過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有專一性，黃曲霉毒素交聯在層析介質中的抗體上。用蒸餾水將免疫親和柱上雜質除去，以甲醇通過免疫親和層析柱洗脫，加入溴溶液衍生，以提高測定靈敏度。洗脫液通過熒光光度計測定黃曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）總量。

3.2 試劑和溶液

3.2.1甲醇（CH3OH）：色譜純

3.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水

3.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水

3.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水

3.2.5 苯：色譜純         不要去掉

3.2.6乙腈：色譜純

3.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯

3.2.8氯化鈉（NaCl）

3.2.9磷酸氫二鈉（Na2HPO4）

3.2.10磷酸二氫鉀（KH2PO4）

3.2.11氯化鉀（KCl）

3.2.12  溴溶液儲備液（0.01%）：稱取適量溴，溶于水，配成0.01%的儲備液，4℃避光保存。

3.2.13  溴溶液工作液（0.002%）：取10mL 0.01%的溴溶液加入40mL水混勻，于棕色瓶中保存備用。需每次使用前配制。

3.2.14      二水硫酸奎寧（C20H24N2O2×H2SO4×2H2O）

3.2.15  硫酸溶液（0.05mol/L）：取2.8mL濃硫酸，緩慢加入適量水中，冷卻后定容至1000mL。

3.2.16  熒光光度計校準溶液：稱取3.40g硫酸奎寧（C20H24N2O2×H2SO4×2H2O）用0.05 mol/L硫酸溶液稀釋至100mL，此溶液熒光光度計讀數相當于20 mg/L黃曲霉毒素標準溶液。

3.3 儀器和設備

3.3.1 熒光光度計

2.3.2 高速均質器：18,000 r/min ~22,000 r/min。

2.3.3 黃曲霉毒素免疫親和柱。

2.3.4 玻璃纖維濾紙：直徑11cm，孔徑1.5μm。

2.3.5 玻璃注射器：10 mL，20mL。

2.3.6 玻璃試管：直徑12 mm ，長75mm，無熒光特性。

2.3.7 空氣壓力泵。

3.4 分析步驟

3.4.1提取

同本標準2.4.1。

3.4.2 凈化

同本標準2.4.2。

3.4.3測定

3.4.3.1    熒光光度計校準

    在激發波長360nm，發射波長450nm條件下，以0.05mol/L硫酸溶液為空白，調節熒光光度計的讀數值為0.0 mg/L；以熒光光度計校準溶液（3.2.16）調節熒光光度計的讀數值為20.0 mg/L。

3.4.3.2    樣液測定

取上述凈化后的甲醇洗脫液加入1.0mL 0.002%溴溶液，混勻，靜置1min，按3.4.3.1條件進行操作，于熒光光度計中讀取樣液中黃曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）的濃度 （mg/L）。

3.4.4空白試驗

用水代替試樣，按3.4.1~3.4.3步驟做空白試驗。

3.4.5結果計算

檢測結果按公式（2）計算：

                        …………（2）

      

式中： — 試樣中黃曲霉毒素（B1、B2、G1或G2）含量，mg/kg；

      — 試樣中黃曲霉毒素B1、B2、G1或G2的含量，mg/L；

      — 空白試驗黃曲霉毒素B1、B2、G1或G2的含量，mg/L；

      — 最終甲醇洗脫液體積，mL；

      — 最終凈化洗脫液所含的試樣質量，g；

      — 試樣稱取量，g；

      — 樣品和提取液總體積，mL；

      — 稀釋用樣品濾液體積，mL；

      — 稀釋液體積，mL；

      — 通過親和柱的樣品提取液體積，mL。注：計算結果需扣除空白值。

        計算結果表示到小數點后1位。