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    厭氧微生物在自然界分布廣泛,種類繁多,其生理作用日益受到人們的重視.雙歧桿菌是專性厭氧菌,對氧氣非常敏感,因此,雙歧桿菌的分離、培養(yǎng)及活菌計數(shù)的關(guān)鍵是提供無氧和低氧化還原電勢的培養(yǎng)環(huán)境.

    雙歧桿菌的最適生長溫度37℃~41℃,最低生長溫度25℃~28℃,最高43℃~45℃.初始最適pH 6.5~7.0,在pH4.5~5.0或pH 8.0~8.5不生長.其細胞呈現(xiàn)多樣形態(tài),有短桿較規(guī)則形、纖細桿狀具有尖細末端形、球形、長桿彎曲形、分枝或分叉形、棍棒狀或匙形.單個或鏈狀、V 形、柵欄狀排列,或聚集成星狀.革蘭氏陽性,不抗酸,不形成芽孢,不運動.雙歧桿菌的菌落光滑、凸圓、邊緣完整、乳脂至白色、閃光并具有柔軟的質(zhì)地.雙歧桿菌是人體內(nèi)的正常生理性細菌,定殖于腸道內(nèi),是腸道的優(yōu)勢菌群,占嬰兒消化道菌叢的92%.該菌與人體終生相伴,其數(shù)量的多少與人體健康密切相關(guān),是目前公認的一類對機體健康有促進作用的代表性有益菌.該菌可以在腸粘膜表面形成一個生理性屏障,從而抵御傷寒沙門氏菌、致瀉性大腸桿菌,痢疾致賀氏菌等病原菌的侵襲,保持機體腸道內(nèi)正常的微生態(tài)平衡;能激活巨噬細胞的活性,增強機體細胞的免疫力;能合成B族維生素、煙酸和葉酸等多種維生素;能控制內(nèi)毒素血癥和防治便秘,預防貧血和佝僂病;可降低亞硝胺等致癌物前體的形成,有防癌和抗癌作用;能拮抗自由基、羥自由基及脂質(zhì)過氧化,具有抗衰老功能.

    雙歧桿菌的培養(yǎng)方法很多,如厭氧箱法、厭氧袋法、厭氧罐法.這些方法都需要特定的除氧措施,操作步驟多,較繁瑣.本實驗介紹的是一種簡便的試管培養(yǎng)法——亨蓋特厭氧滾管技術(shù),亨蓋特厭氧滾管技術(shù)是美國微生物學家亨蓋特于1950年首次提出并應(yīng)用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養(yǎng)技術(shù).以后這項技術(shù)又經(jīng)歷了幾十年的不斷改進,從而使亨蓋特厭氧技術(shù)日趨完善,并逐漸發(fā)展成為研究厭氧微生物的一套完整技術(shù),而且多年來的實踐已經(jīng)證明它是研究嚴格、專性厭氧菌的一種極為有效的技術(shù).該技術(shù)的優(yōu)點是:預還原培養(yǎng)基制好后,可隨時取用進行試驗;任何時間觀察或檢查試管內(nèi)的菌都不會干擾厭氧條件.

    目前,雙歧桿菌鑒定的方法有很多種.近年來興起的一種新的RAPD等分子生物學技術(shù)對雙歧桿菌進行基因指紋圖譜的構(gòu)建,分析不同雙歧桿菌種間存在的同源性和多態(tài)性;RAPD技術(shù)也可用于雙歧桿菌菌種鑒定及分型.一般來講,我們都應(yīng)用適合鑒定所有厭氧菌的方法,主要包括雙歧桿菌特定酶的檢測、乙酸、乳酸等有機酸的測定、糖發(fā)酵試驗和其他相關(guān)指標等.

 

實驗用具

    高純氮氣 厭氧管 注射器 培養(yǎng)箱 冰塊 水浴鍋 鑷子 記號筆 MRS培養(yǎng)基 細菌生化微量鑒定管 酒精棉球 瓷盤 振蕩器 銅柱除氧系統(tǒng) 定量加樣器 恒溫水浴 載玻片 顯微鏡 恒溫培養(yǎng)箱 超聲波破碎儀 濾紙 層析缸 酒精燈 封口膜 厭氧罐 等.

實驗方法與步驟

1.銅柱系統(tǒng)除氧

    銅柱是一個內(nèi)部裝有銅絲或銅屑的硬質(zhì)玻璃管.此管的大小為40～400mm,兩端被加工成漏斗狀,外壁繞有加熱帶,并與變壓器相連來控制電壓和穩(wěn)定銅柱的溫度.銅柱兩端連接膠管,一端連接氣鋼瓶,另一端連接出氣管口.由于從氣鋼瓶出來的氣體如N2、CO2和H2等都含有微量O2,故當這些氣體通過溫度約360℃的銅柱時,銅和氣體中的微量O2化合生成CuO,銅柱則由明亮的黃色變?yōu)楹谏?當向氧化狀的銅柱通入H2時,H2與CuO中的氧就結(jié)合形成 H2O,而CuO又被還原成了銅,銅柱則又呈現(xiàn)明亮的黃色.此銅柱可以反復的使用,并不斷起到除氧的目的.當然H2源也可以由氫氣發(fā)生器產(chǎn)生.

 

2.預還原培養(yǎng)基及稀釋液的制備

    制作預還原培養(yǎng)基及稀釋液時,先將配置好的培養(yǎng)基和稀釋液煮沸驅(qū)氧,而后用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中,一般瓊脂培養(yǎng)基裝4.5～5.0mL,稀釋液裝9mL,并插入通N2氣的長針頭以排除O2.此時可以清楚的看到培養(yǎng)基內(nèi)加入的氧化還原指示劑—刃天青由藍到紅最后變成無色,說明試管內(nèi)已成為無氧狀態(tài),然后蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋,滅菌備用.

 

3.分離

（1）編號

取五支無菌水試管,分別用記號筆標明10-1、10-2……10-5.

（2）稀釋

在無菌條件下,用無菌注射器吸取1mL混合均勻的液體樣品,加入裝有預還原生理鹽水的厭氧試管中,用震蕩器將其混合均勻,制成10-1稀釋液.用無菌注射器吸取1mL10-1稀釋液至另一裝有9mL生理鹽水的厭氧試管中,制成10-2稀釋液.依此進行10倍系列稀釋,至10-7,制成不同樣品稀釋液.通常選10-5、10-6、10-7三個稀釋度進行滾管計數(shù).

（3）滾管分離

1）滾管

將無氧無菌的瓊脂培養(yǎng)基在沸水浴中溶化,置46-50℃恒溫的水浴中,待用,用無菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三個稀釋度各0 .1mL,分別注入待用的試管中,然后將其平放于盛有冰水的瓷盤中迅速滾動,帶菌的溶化瓊脂在試管內(nèi)壁會即刻形成凝固層.

2）分離

生成的菌落需挑取出來,鏡檢其形態(tài)及純度.如尚未獲得純培養(yǎng)物,需再次稀釋滾管,并再次挑取菌落,直至獲得純培養(yǎng)物為止.待挑取的單菌落預先在放大鏡下觀察確定,做好標記.然后將培養(yǎng)基試管固定于適當?shù)闹Ъ苌?打開試管膠塞,同時迅速將氣流適當、火焰滅過菌的氮氣長針頭插入管內(nèi).同時,另一液體厭氧管去掉膠塞插入另一滅過菌的通氣針頭.將準備好的彎頭毛細管小心插入固體培養(yǎng)基內(nèi),找準待挑菌落,輕輕吸取,轉(zhuǎn)移至液體試管內(nèi),加塞.37℃培養(yǎng).培養(yǎng) 24h或待培養(yǎng)液混濁后檢查已分離培養(yǎng)物的純度.

4.計數(shù)并鏡檢

（1）計數(shù)

液體純培養(yǎng)物經(jīng)系列稀釋后,按上述滾管法培養(yǎng).然后對固體滾管計數(shù),計算每克或每毫升樣品中含有的雙歧桿菌數(shù)量.公式如下:

雙歧桿菌數(shù)量cfu/g（mL）樣品=0.1mL滾管計數(shù)的實際平均值×10×稀釋倍數(shù)

（2）鏡檢

挑取特征性菌落制片,革蘭氏染色后鏡檢,觀察菌體形態(tài).

 

5.菌種鑒定

（1）雙歧桿菌特定酶的檢測

    利用果糖-6-磷酸鹽對分離得到的菌種進行果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶（F6PPK）的測定,初步確定菌種是否為雙歧桿菌屬.F6PPK測定的操作如下:

①將從樣品中分離出的雙歧桿菌培養(yǎng)于厭氧液體改良MRS培養(yǎng)基中37℃生長24 h.

②將菌液4400 rpm離心10 min,收集菌體,緩沖液ⅰ洗滌2次,最后溶于約4 mL緩沖液ⅰ中,制成細菌懸液.

緩沖液ⅰ:現(xiàn)用現(xiàn)配.取0.05 M Na2HPO4 31.5 mL和0.05 M NaH2PO468.5 mL,再加500 mg/L半胱氨酸-鹽酸鹽.

③用超聲波粉碎儀,400 W條件下;每處理5 s、間隔5 s,超聲粉碎8 min,至菌體溶液呈半透明.

④破碎后,取0.5 mL于離心管中,加試劑ⅱ和ⅲ各125 µL,37℃保溫30 min.

ⅱ6 mg/mL氟化鈉加10 mg/mL碘乙酸鈉.

ⅲ果糖-6-磷酸鹽80 mg/mL水溶液.

⑤加試劑ⅳ0.750mL,室溫10 min.

ⅳ現(xiàn)用現(xiàn)配.鹽酸羥胺139 mg/mL.酸性極強,用氫氧化鈉中和至pH6.5.

⑥加試劑ⅴ和ⅵ各500 µL,室溫5 min.

ⅴ三氯乙酸（TCA）水溶液15 g/100 mL.

ⅵ4 M HCl.

⑦加試劑ⅶ500 µL,顯色.紅褐色或紅紫色為陽性,黃色為陰性.

ⅶ0.5 g/100 mL FeCl3·6H2O溶于0.1 MHCl.

（2）乙酸、乳酸等有機酸的測定——紙層析法

①層析濾紙的制備——將層析濾紙剪成1.5cm*11cm的長條狀,在距層析紙一端約4cm處用鉛筆劃線確定點陽線,使用前充分干燥.

②配制展開劑——正丁醇:甲酸:水=80:15:5

③配制標準液——配制1.5%的乳酸、1.5%的乙酸溶液

④制備待測樣品——將菌種37℃培養(yǎng)24h后離心,收集上清液

⑤點樣——用毛細管分別吸取發(fā)酵液,多次點樣于濾紙條上,樣點直徑不宜超過2mm,平衡2h

⑥層析——將點好樣的層析紙放入,使點有樣品的一端浸在展開劑中,但不可浸及樣點.觀察展開情況,待展開劑前沿到達離層析紙另一端約1.5cm處,取出層析紙.

⑦ 顯色——以3%溴甲酚藍酒精溶液為顯色劑,待層析液揮發(fā)之后,向?qū)游鰹V紙噴灑并計算Rf值.

    注釋:物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf值(比移值Rfvalue又稱Rf值)來表示:

Rf=原點到層析中心的距離/原點到溶劑前沿的距離

    在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù).Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān),是一個定性分析的重要參數(shù).

（3）糖發(fā)酵試驗

    糖發(fā)酵實驗是最常用的生化反應(yīng),在腸道細菌鑒定上尤為重要.絕大多數(shù)細菌都能利用糖類作為碳源和能源,但是它們在分解糖的能力上有很大差異,有些細菌能分解糖并產(chǎn)酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫、甲烷、二氧化碳等）;有些細菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣.例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣;傷寒桿菌能分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,不能分解乳糖;普通變形桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,不能分解乳糖.酸的產(chǎn)生可以利用指示劑來斷定.在配制培養(yǎng)基時預先加入溴甲酚紫[pH5.2(黃色)—6.8（紫色）],當發(fā)酵產(chǎn)酸時,可使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色.氣體的產(chǎn)生可由發(fā)酵管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡來證明.

    本實采用現(xiàn)成的細菌生化微量鑒定管 ,鑒定管的種類如下:

    乳糖 麥芽糖 甘露糖 甘露醇 蔗糖 阿拉伯糖D-核糖 木糖（木膠糖） 半乳糖 松三糖 山梨糖 淀粉 水楊素 葡萄糖酸鹽 草糖（海藻糖） 血清菊糖 棉子糖 果糖 蜜二糖 纖維二糖

    具體實驗步驟:

① 將菌液進行適當稀釋,之后在無菌環(huán)境下,取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中,用無菌封口膜封口.

② 將接種后的鑒定管放入?yún)捬豕拗?充足氮氣后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng).

③24h后觀察各管中液體變顏色情況,若變色則為陽性,反之陰性,對照凌代文編著的《乳酸細菌分類鑒定及試驗方法》“鑒別雙歧桿菌屬內(nèi)種的特征”表即可初步確定其種別.