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絕大多數(shù)細(xì)菌在適宜的條件下可以生長(zhǎng)，細(xì)菌感染性患者標(biāo)本只有經(jīng)過(guò)細(xì)菌的分離培養(yǎng)、鑒定和藥物敏感試驗(yàn)，才可對(duì)感染性疾病進(jìn)行病原學(xué)診斷并指導(dǎo)臨床用藥。因此，細(xì)菌培養(yǎng)對(duì)疾病的診斷、預(yù)防和治療具有重要的作用。
細(xì)菌分離培養(yǎng)主要用于臨床標(biāo)本(如血液、痰、糞便等)或培養(yǎng)物中有多種細(xì)菌時(shí)對(duì)某一種細(xì)菌的分離。通過(guò)分離，可使細(xì)菌在平板上分散生長(zhǎng)，便于觀察單個(gè)菌落特性，也易于挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行生化鑒定。
一、基本條件
細(xì)菌分離培養(yǎng)的基本條件包括接種用具(接種環(huán)、接種針)、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)基，以及無(wú)菌室和超凈工作臺(tái)等。
(一)接種用具
包括接種環(huán)和接種針兩類。接種環(huán)用來(lái)挑取標(biāo)本、菌液及平板劃線等。接種針則用來(lái)挑取單個(gè)菌落，穿刺高層瓊脂等。接種環(huán)(針)由環(huán)(針)、金屬柄和絕緣柄3部分組成，環(huán)(針)一般采用鉑絲制作最佳，其硬度適宜，易于傳熱，火焰滅菌后冷卻快，經(jīng)久耐用。但因其價(jià)格昂貴，目前多用電熱(鎳)絲及l(fā)次性塑料接種環(huán)代替。
接種環(huán)的直徑一般為2～4mm，長(zhǎng)5～8cm，定量接種環(huán)容量為1/300ml、1/200ml、1/100ml，用于定量培養(yǎng)。
(二)培養(yǎng)箱
1．普通培養(yǎng)箱 可自動(dòng)調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度(一般為35～37℃)，用于培養(yǎng)普通需氧或兼性厭氧菌。
2．二氧化碳培養(yǎng)箱 可自動(dòng)調(diào)節(jié)二氧化碳濃度(一般為5％～l0％)和培養(yǎng)溫度，用于分離培養(yǎng)嗜血桿菌和奈瑟菌等生長(zhǎng)時(shí)需二氧化碳的細(xì)菌，尤其是初次分離培養(yǎng)時(shí)。如無(wú)二氧化碳培養(yǎng)箱時(shí)，也可用燭缸法代替。
3．厭氧袋、厭氧罐(盒)和厭氧手套箱用于分離培養(yǎng)厭氧菌。厭氧袋為透明的、不透氣的塑料袋。厭氧罐為密封的塑料或玻璃罐(盒)，可用物理或化學(xué)方法去除袋、罐中的氧氣，達(dá)到無(wú)氧狀態(tài)。厭氧手套箱則可通過(guò)換氣裝置快速達(dá)到、持續(xù)保持無(wú)氧狀態(tài)，并自動(dòng)調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度，還可通過(guò)手套在箱內(nèi)進(jìn)行分離接種、生化鑒定等操作。
(三)培養(yǎng)基
培養(yǎng)基(culture medium)是由人工方法配制而成的，適合微生物生長(zhǎng)繁殖使用的混合營(yíng)養(yǎng)物制品。適宜的培養(yǎng)基不僅可用于細(xì)菌的分離純化培養(yǎng)、傳代、菌種保存，還可用于研究細(xì)菌的生理、化學(xué)特性，是對(duì)病原菌分離鑒定的重要環(huán)節(jié)和必不可少的手段。培養(yǎng)基按其性狀分為固體、半固體和液體培養(yǎng)基；按其用途分為基礎(chǔ)、營(yíng)養(yǎng)、選擇、鑒別和特殊培養(yǎng)基。
1．基礎(chǔ)培養(yǎng)基(based medium) 含有基礎(chǔ)生長(zhǎng)所需的基本營(yíng)養(yǎng)成分，最常用的是肉浸液，主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。基礎(chǔ)培養(yǎng)基廣泛用于細(xì)菌的增菌、檢驗(yàn)，也是制備其他培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。
2．營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(nutrient medium) 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入葡萄糖、血液、生長(zhǎng)因子等特殊成分，供營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌和需要特殊生長(zhǎng)因子的細(xì)菌生長(zhǎng)。最常用的是血瓊脂平板、巧克力平板等。
3．選擇培養(yǎng)基(selective medium) 在培養(yǎng)基中加入選擇性抑制物質(zhì)，有利于目的菌的檢出和識(shí)別，而抑制其他非目的菌。例如，麥康凱瓊脂平板可以抑制球菌及革蘭陽(yáng)性桿菌生長(zhǎng)，有利于腸道菌生長(zhǎng)，稱弱選擇性培養(yǎng)基；SS瓊脂平板除有上述作用外，還可
抑制腸道非致病菌的生長(zhǎng)，故稱強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基。
4．鑒別培養(yǎng)基(differential medium)利用細(xì)菌分解糖類和蛋白質(zhì)的能力及其代謝產(chǎn)物的不同，在培養(yǎng)基中加入特定的作用底物和指示劑，用于觀察細(xì)菌各種生化反應(yīng)，以鑒別和鑒定細(xì)菌。例如糖發(fā)酵管、克氏雙糖鐵瓊脂(KIA)、伊紅-亞甲藍(lán)(美藍(lán))瓊脂等。
5．特殊培養(yǎng)基(special medium) 包括厭氧培養(yǎng)基和細(xì)菌L型培養(yǎng)基等。前者是培養(yǎng)專性厭氧菌的培養(yǎng)基，除含營(yíng)養(yǎng)成分外，還加入還原劑以降低培養(yǎng)基的氧化還原電勢(shì)。后者是針對(duì)細(xì)胞壁缺損的細(xì)菌L型，由于胞內(nèi)滲透壓較高，故培養(yǎng)基必須采用高滲低瓊脂培養(yǎng)基。
二、接種分離技術(shù)
為了從臨床標(biāo)本中分離出病原菌并進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，除選擇好合適的培養(yǎng)基外，還要根據(jù)待檢標(biāo)本的來(lái)源、培養(yǎng)目的及所使用培養(yǎng)基的性狀，采用不同的接種方法。
（一）平板劃線分離法
使標(biāo)本或培養(yǎng)物中混雜的多種細(xì)菌在培養(yǎng)基表面分散生長(zhǎng)，各自形成菌落。一般要求單個(gè)菌落是一種細(xì)菌的純培養(yǎng)。但很多情況下單個(gè)菌落并非只有一種細(xì)菌，特別是標(biāo)本直接劃線的開(kāi)始區(qū)域生長(zhǎng)的單個(gè)菌落分離結(jié)果不純，一般選擇菌落形成較稀少區(qū)域的單個(gè)菌落，必要時(shí)先稀釋標(biāo)本再劃線。待菌落長(zhǎng)出，后，挑選單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)種到另一培養(yǎng)基中，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。平板劃線法可分為以下幾種：
1．分區(qū)劃線法此法多用于糞便等含菌量較多的標(biāo)本。先將標(biāo)本均勻涂于平板表面邊緣一小部分(第1區(qū))；然后燒灼接種環(huán)，將環(huán)通過(guò)第l區(qū)3～4次，連續(xù)劃線(為第2區(qū))；依次劃3、4區(qū)。平板上每l區(qū)的細(xì)菌數(shù)會(huì)逐漸減少，直至分離出單個(gè)菌落(圖5-4)。
2．連續(xù)劃線法 本法一般用于接種含菌數(shù)量相對(duì)較少的標(biāo)本或培養(yǎng)物。先將標(biāo)本均勻涂布于平板邊緣一小部分，并由此開(kāi)始，在平板表面連續(xù)劃線并逐漸下移，直至劃滿平板表面。
3．棋盤格劃線法此法多用于含菌量較多的臨床標(biāo)本，如痰、糞便等標(biāo)本的初代分離培養(yǎng)。其優(yōu)點(diǎn)是整個(gè)平板的3/4～4/5區(qū)
域(即棋盤格范圍)均為有效分離區(qū)。將標(biāo)本涂布于平板約l/5處，接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌后，自原處做平行劃線5～6條。接種環(huán)燒灼后冷卻，劃垂直線5～6條，形成正方形格；再以同法劃兩排斜線，使呈棋盤形。
(二)斜面接種法
該法主要用于純種增菌及保存菌種。挑取單個(gè)菌落從斜面底部自下向上劃一條直線，再?gòu)牡撞块_(kāi)始向上劃曲線接種，盡可能密而勻，或者直接自下而上劃曲線接種。
(三)液體接種法
以接種環(huán)沾取菌種，傾斜液體培養(yǎng)管，在液面與管壁交界處研磨接種物(以試管直立后液體應(yīng)淹沒(méi)接種物為準(zhǔn))。多用于普通肉湯、蛋白胨水等液體培養(yǎng)基的接種。
(四)穿刺接種法
此法用于保存菌種、觀察動(dòng)力及某些生化反應(yīng)。以接種針挑取細(xì)菌培養(yǎng)物，插入半固體培養(yǎng)基的中央，穿刺至培養(yǎng)基底部，然后沿原穿刺線退出接種針。其他操作與斜面接種類似。
(五)傾注平板法
取純培養(yǎng)物的稀釋液或原標(biāo)本，混勻于已融化并冷卻到50℃左右15ml的瓊脂管中，無(wú)菌法傾注于無(wú)菌平皿，凝固后培養(yǎng)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。該法適用于兼性厭氧菌或厭氧菌稀釋定量培養(yǎng)，也用于飲料、牛乳和尿液等液體標(biāo)本活細(xì)菌計(jì)數(shù)。
細(xì)菌分離培養(yǎng)主要用于臨床標(biāo)本(如血液、痰、糞便等)或培養(yǎng)物中有多種細(xì)菌時(shí)對(duì)某一種細(xì)菌的分離。通過(guò)分離，可使細(xì)菌在平板上分散生長(zhǎng)，便于觀察單個(gè)菌落特性，也易于挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行生化鑒定。
一、基本條件
細(xì)菌分離培養(yǎng)的基本條件包括接種用具(接種環(huán)、接種針)、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)基，以及無(wú)菌室和超凈工作臺(tái)等。
(一)接種用具
包括接種環(huán)和接種針兩類。接種環(huán)用來(lái)挑取標(biāo)本、菌液及平板劃線等。接種針則用來(lái)挑取單個(gè)菌落，穿刺高層瓊脂等。接種環(huán)(針)由環(huán)(針)、金屬柄和絕緣柄3部分組成，環(huán)(針)一般采用鉑絲制作最佳，其硬度適宜，易于傳熱，火焰滅菌后冷卻快，經(jīng)久耐用。但因其價(jià)格昂貴，目前多用電熱(鎳)絲及l(fā)次性塑料接種環(huán)代替。
接種環(huán)的直徑一般為2～4mm，長(zhǎng)5～8cm，定量接種環(huán)容量為1/300ml、1/200ml、1/100ml，用于定量培養(yǎng)。
(二)培養(yǎng)箱
1．普通培養(yǎng)箱 可自動(dòng)調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度(一般為35～37℃)，用于培養(yǎng)普通需氧或兼性厭氧菌。
2．二氧化碳培養(yǎng)箱 可自動(dòng)調(diào)節(jié)二氧化碳濃度(一般為5％～l0％)和培養(yǎng)溫度，用于分離培養(yǎng)嗜血桿菌和奈瑟菌等生長(zhǎng)時(shí)需二氧化碳的細(xì)菌，尤其是初次分離培養(yǎng)時(shí)。如無(wú)二氧化碳培養(yǎng)箱時(shí)，也可用燭缸法代替。
3．厭氧袋、厭氧罐(盒)和厭氧手套箱用于分離培養(yǎng)厭氧菌。厭氧袋為透明的、不透氣的塑料袋。厭氧罐為密封的塑料或玻璃罐(盒)，可用物理或化學(xué)方法去除袋、罐中的氧氣，達(dá)到無(wú)氧狀態(tài)。厭氧手套箱則可通過(guò)換氣裝置快速達(dá)到、持續(xù)保持無(wú)氧狀態(tài)，并自動(dòng)調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度，還可通過(guò)手套在箱內(nèi)進(jìn)行分離接種、生化鑒定等操作。
(三)培養(yǎng)基
培養(yǎng)基(culture medium)是由人工方法配制而成的，適合微生物生長(zhǎng)繁殖使用的混合營(yíng)養(yǎng)物制品。適宜的培養(yǎng)基不僅可用于細(xì)菌的分離純化培養(yǎng)、傳代、菌種保存，還可用于研究細(xì)菌的生理、化學(xué)特性，是對(duì)病原菌分離鑒定的重要環(huán)節(jié)和必不可少的手段。培養(yǎng)基按其性狀分為固體、半固體和液體培養(yǎng)基；按其用途分為基礎(chǔ)、營(yíng)養(yǎng)、選擇、鑒別和特殊培養(yǎng)基。
1．基礎(chǔ)培養(yǎng)基(based medium) 含有基礎(chǔ)生長(zhǎng)所需的基本營(yíng)養(yǎng)成分，最常用的是肉浸液，主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。基礎(chǔ)培養(yǎng)基廣泛用于細(xì)菌的增菌、檢驗(yàn)，也是制備其他培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。
2．營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(nutrient medium) 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入葡萄糖、血液、生長(zhǎng)因子等特殊成分，供營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌和需要特殊生長(zhǎng)因子的細(xì)菌生長(zhǎng)。最常用的是血瓊脂平板、巧克力平板等。
3．選擇培養(yǎng)基(selective medium) 在培養(yǎng)基中加入選擇性抑制物質(zhì)，有利于目的菌的檢出和識(shí)別，而抑制其他非目的菌。例如，麥康凱瓊脂平板可以抑制球菌及革蘭陽(yáng)性桿菌生長(zhǎng)，有利于腸道菌生長(zhǎng)，稱弱選擇性培養(yǎng)基；SS瓊脂平板除有上述作用外，還可
抑制腸道非致病菌的生長(zhǎng)，故稱強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基。
4．鑒別培養(yǎng)基(differential medium)利用細(xì)菌分解糖類和蛋白質(zhì)的能力及其代謝產(chǎn)物的不同，在培養(yǎng)基中加入特定的作用底物和指示劑，用于觀察細(xì)菌各種生化反應(yīng)，以鑒別和鑒定細(xì)菌。例如糖發(fā)酵管、克氏雙糖鐵瓊脂(KIA)、伊紅-亞甲藍(lán)(美藍(lán))瓊脂等。
5．特殊培養(yǎng)基(special medium) 包括厭氧培養(yǎng)基和細(xì)菌L型培養(yǎng)基等。前者是培養(yǎng)專性厭氧菌的培養(yǎng)基，除含營(yíng)養(yǎng)成分外，還加入還原劑以降低培養(yǎng)基的氧化還原電勢(shì)。后者是針對(duì)細(xì)胞壁缺損的細(xì)菌L型，由于胞內(nèi)滲透壓較高，故培養(yǎng)基必須采用高滲低瓊脂培養(yǎng)基。
二、接種分離技術(shù)
為了從臨床標(biāo)本中分離出病原菌并進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，除選擇好合適的培養(yǎng)基外，還要根據(jù)待檢標(biāo)本的來(lái)源、培養(yǎng)目的及所使用培養(yǎng)基的性狀，采用不同的接種方法。
（一）平板劃線分離法
使標(biāo)本或培養(yǎng)物中混雜的多種細(xì)菌在培養(yǎng)基表面分散生長(zhǎng)，各自形成菌落。一般要求單個(gè)菌落是一種細(xì)菌的純培養(yǎng)。但很多情況下單個(gè)菌落并非只有一種細(xì)菌，特別是標(biāo)本直接劃線的開(kāi)始區(qū)域生長(zhǎng)的單個(gè)菌落分離結(jié)果不純，一般選擇菌落形成較稀少區(qū)域的單個(gè)菌落，必要時(shí)先稀釋標(biāo)本再劃線。待菌落長(zhǎng)出，后，挑選單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)種到另一培養(yǎng)基中，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。平板劃線法可分為以下幾種：
1．分區(qū)劃線法此法多用于糞便等含菌量較多的標(biāo)本。先將標(biāo)本均勻涂于平板表面邊緣一小部分(第1區(qū))；然后燒灼接種環(huán)，將環(huán)通過(guò)第l區(qū)3～4次，連續(xù)劃線(為第2區(qū))；依次劃3、4區(qū)。平板上每l區(qū)的細(xì)菌數(shù)會(huì)逐漸減少，直至分離出單個(gè)菌落(圖5-4)。
2．連續(xù)劃線法 本法一般用于接種含菌數(shù)量相對(duì)較少的標(biāo)本或培養(yǎng)物。先將標(biāo)本均勻涂布于平板邊緣一小部分，并由此開(kāi)始，在平板表面連續(xù)劃線并逐漸下移，直至劃滿平板表面。
3．棋盤格劃線法此法多用于含菌量較多的臨床標(biāo)本，如痰、糞便等標(biāo)本的初代分離培養(yǎng)。其優(yōu)點(diǎn)是整個(gè)平板的3/4～4/5區(qū)
域(即棋盤格范圍)均為有效分離區(qū)。將標(biāo)本涂布于平板約l/5處，接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌后，自原處做平行劃線5～6條。接種環(huán)燒灼后冷卻，劃垂直線5～6條，形成正方形格；再以同法劃兩排斜線，使呈棋盤形。
(二)斜面接種法
該法主要用于純種增菌及保存菌種。挑取單個(gè)菌落從斜面底部自下向上劃一條直線，再?gòu)牡撞块_(kāi)始向上劃曲線接種，盡可能密而勻，或者直接自下而上劃曲線接種。
(三)液體接種法
以接種環(huán)沾取菌種，傾斜液體培養(yǎng)管，在液面與管壁交界處研磨接種物(以試管直立后液體應(yīng)淹沒(méi)接種物為準(zhǔn))。多用于普通肉湯、蛋白胨水等液體培養(yǎng)基的接種。
(四)穿刺接種法
此法用于保存菌種、觀察動(dòng)力及某些生化反應(yīng)。以接種針挑取細(xì)菌培養(yǎng)物，插入半固體培養(yǎng)基的中央，穿刺至培養(yǎng)基底部，然后沿原穿刺線退出接種針。其他操作與斜面接種類似。
(五)傾注平板法
取純培養(yǎng)物的稀釋液或原標(biāo)本，混勻于已融化并冷卻到50℃左右15ml的瓊脂管中，無(wú)菌法傾注于無(wú)菌平皿，凝固后培養(yǎng)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。該法適用于兼性厭氧菌或厭氧菌稀釋定量培養(yǎng)，也用于飲料、牛乳和尿液等液體標(biāo)本活細(xì)菌計(jì)數(shù)。
