一、增菌
稱取檢樣25g,加入裝有225mLGN增菌液的500mL廣口瓶內,固體食品用均質器以8000-10000r/min打碎1min,或用乳缽加滅菌砂磨碎,粉狀食品用金屬匙或玻璃棒研磨使其乳化,于36℃培養6~8h。
培養時間視細菌生長情況而定,當培養液出現輕微混濁時即應中止培養。
二、分離和初步生化試驗
取增菌液1環,劃線接種于HE瓊脂平板或SS瓊脂平板1個;另取1環劃線接種于麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍瓊脂平板各1個,于36℃培養18~24h。
志賀氏菌在這些培養基上呈現無色透明不發酵乳糖的菌落。
在沙門氏菌的檢驗中,有時也使用HE、SS平板進行初步篩選。
SN 0332-94 出口食品中沙門氏菌(辛酯酶熒光)檢驗方法
挑取平板上的可疑菌落,接種三糖鐵瓊脂和葡萄糖半固體各1管。一般應多挑幾個菌落,以防遺漏,經36℃培養18~24h,分別觀察結果。
附:葡萄糖半固體原理及結果。
下述培養物可以棄去:
a. 在三糖鐵瓊脂斜面上呈蔓延生長的培養物;
b. 在18~24h內發酵乳糖、蔗糖的培養物;
c. 不分解葡萄糖和只生長在半固體表面的培養物;
d. 產氣的培養物;
e. 有動力的培養物;
f. 產生硫化氫的培養物。
凡是乳糖、蔗糖不發酵,葡萄糖產酸不產氣(福氏志賀氏菌6型可產生少量氣體),無動力的菌株,可做血清學分型和進一步的生化試驗。
三、血清學分型
挑取三糖鐵瓊脂上的培養物,做玻片凝集試驗。
先用4種志賀氏菌多價血清檢查,如果由于K抗原的存在而不出現凝集,應將菌液煮沸后再檢查;
如果呈現凝集,則用A1、A2、B群多價和D群血清分別試驗。
如系B群福氏志賀氏菌,則用群和型因子血清分別檢查。福氏志賀氏菌各型和亞型的型和群抗原見表1?上扔萌阂蜃友鍣z查,再根據群因子血清出現凝集的結果,依次選用型因子血清檢查。
4種志賀氏菌多價血清不凝集的菌株,可用鮑氏多價1、2、3分別檢查,并進一步用1~15各型因子血清檢查。如果鮑氏多價血清不凝集,可用痢疾志賀氏菌3~12型多價血清及各型因子血清檢查。
附:福氏志賀氏菌各型和亞型的型抗原和群抗原
四、進一步的生化試驗
在做血清學分型的同時,應做進一步的生化試驗,即:
葡萄糖銨
西蒙氏檸檬酸鹽
賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶
pH7.2尿素
KCN生長
水楊苷和七葉苷的分解
除宋內氏菌和鮑氏13型為烏氨酸陽性外,志賀氏菌屬的培養物均為陰性結果。
。必要時還應做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗,應為氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌。生化反應不符合的菌株,即使能與某種志賀氏菌分型血清發生凝集,仍不得判定為志賀氏菌屬的培養物。
已判定為志賀氏菌屬的培養物,應進一步做
5%乳糖發酵
甘露醇
棉子糖
甘油的發酵
靛基質試驗
志賀氏菌屬4個生化群的培養物,應符合該群的生化特性。但福氏6型的生化特性與A群或C群相似。
附:志賀氏菌屬四個群的生化特性
五、結果報告:綜合生化和血清學的試驗結果判定菌型并作出報告。