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摘要 目的：探討方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移成功的判定標(biāo)準(zhǔn)。方法：結(jié)合近年來方法學(xué)研究的新進(jìn)展，特別是統(tǒng)計學(xué)在該領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展，分析目前方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移法規(guī)或文獻(xiàn)中的表述不清晰問題，探討引入統(tǒng)計學(xué)中的預(yù)測區(qū)間、容忍區(qū)間和方法能力指數(shù)作為確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移成功的判定標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果：方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移方案遵循方法驗證的操作步驟，實驗設(shè)計僅需實驗者按方法驗證要求進(jìn)行獨立重復(fù)操作；若該操作過程所獲得的報告值在方法驗證結(jié)果的預(yù)測區(qū)間內(nèi)，則可以判定方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移成功；當(dāng)該報告值超出方法驗證結(jié)果的容忍區(qū)間，則可判定方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移不成功；當(dāng)該報告值在容忍區(qū)間和預(yù)測區(qū)間范圍之間時，應(yīng)關(guān)注實驗過程并嘗試進(jìn)一步改進(jìn)方法。此外，也可通過方法能力指數(shù)作為判定確認(rèn)和轉(zhuǎn)移的依據(jù)。結(jié)論：當(dāng)使用新的確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移實驗設(shè)計方案時，采用與方法驗證結(jié)果的預(yù)測區(qū)間和容忍區(qū)間進(jìn)行比較的方式以及使用方法能力指數(shù)進(jìn)行評估的方式；兩者作為判定方法確認(rèn)和轉(zhuǎn)移是否成功的標(biāo)準(zhǔn)具有明顯優(yōu)勢。同時可有效降低方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移過程所導(dǎo)致的誤判風(fēng)險。正 文 分析方法的確認(rèn)（verification）和轉(zhuǎn)移（transfer）是方法生命周期中的重要環(huán)節(jié)，兩者都是對已驗證（validation）方法是否能持續(xù)滿足其預(yù)期用途（intended use）的確證（confirmed or qualified）過程。方法確認(rèn)［1-2］是指首次使用（經(jīng)官方驗證的）法定分析方法時，由現(xiàn)有的分析人員或?qū)嶒炇覍Ψ治龇椒ㄖ嘘P(guān)鍵的驗證指標(biāo)進(jìn)行有選擇性的考察，以證明方法對所分析樣品的適用性，同時證明分析人員有能力使用該法定分析方法；而方法轉(zhuǎn)移［3-4］是一個文件記錄和實驗確認(rèn)的過程，目的是證明一個實驗室（方法接收實驗室）在采用另一實驗室（方法建立實驗室）建立并經(jīng)過驗證的非法定分析方法檢測樣品時，該實驗室有能力成功地操作該方法，檢測結(jié)果具有原研實驗室的可靠性。分析方法轉(zhuǎn)移是保證不同實驗室之間獲得一致、可靠和準(zhǔn)確檢測結(jié)果的重要環(huán)節(jié)，同時也是對實驗室檢測能力的重要評估。經(jīng)驗證的方法只有成功的確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移，即滿足方法的預(yù)期用途，才能說明該方法具有持續(xù)使用的價值。換言之，任何方法在實際應(yīng)用過程中都離不開持續(xù)確證環(huán)節(jié)[本文由藥研公眾號整理排版]。 目前國內(nèi)外有關(guān)分析方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移的法規(guī)和文獻(xiàn)很多［1-13］，其中闡述最詳盡的文件是美國藥典（USP）的<1226>［1］和<1224>［3］，其他法規(guī)文件［7-13］的內(nèi)容主要集中在對基本概念、確認(rèn)和轉(zhuǎn)移的要求、方案和報告、轉(zhuǎn)移的類型和原則，以及適用范圍的剖析，卻少有對確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移成功之判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行詳細(xì)闡述，以至于國內(nèi)外質(zhì)量分析人員在進(jìn)行方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移時總是為以下問題所困擾：（1）方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移究竟需要對哪些方法的性能指標(biāo)（如準(zhǔn)確度、精密度、專屬性等）進(jìn)行選擇性的論證或提供證據(jù)；（2）具體哪些方法性能指標(biāo)最重要，是否應(yīng)該將方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移按照方法驗證方案實施1 遍才最可靠；（3）這些性能指標(biāo)或方法的檢測結(jié)果與驗證實驗的結(jié)果差多少符合確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移成功的標(biāo)準(zhǔn)。隨著近年來GMP 和實驗室認(rèn)證的深入，以上問題一直是實驗分析人員的困惑所在。目前針對方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移判定標(biāo)準(zhǔn)多為ICH Q2（R1）所規(guī)定性能指標(biāo)的均值、偏差及置信區(qū)間等評價參數(shù)［10］，部分實驗室主要依據(jù)經(jīng)驗對這些參數(shù)是否能保證方法的預(yù)期用途進(jìn)行判斷，卻很少給出相應(yīng)的科學(xué)論證。這類現(xiàn)象的存在對方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移準(zhǔn)確評估有著相當(dāng)大的風(fēng)險。 本文結(jié)合近10 年來分析方法的理論研究進(jìn)展，首先分析了方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移的評價指標(biāo)選擇問題；然后利用統(tǒng)計學(xué)原理，結(jié)合實例深入探討了判定確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移成功的標(biāo)準(zhǔn)問題；最后，對目前存在的一些觀點和問題進(jìn)行了分析和討論。希望本文對方法確認(rèn)和轉(zhuǎn)移的標(biāo)準(zhǔn)探討能為今后更高效、更科學(xué)地保證方法性能一致性的實施帶來幫助。 1 方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移的指標(biāo)選擇 目前，國內(nèi)外的法規(guī)或文件對方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移的探討多集中在對性能指標(biāo)的選擇問題方面。法規(guī)多給出基本原則，一些學(xué)者則論述具體評價指標(biāo)，但觀點存在分歧。目前普遍是對專屬性、準(zhǔn)確度、精密度等方法性能指標(biāo)進(jìn)行考察［8-12］或根據(jù)產(chǎn)品特性選擇性的進(jìn)行性能指標(biāo)［10］考察，后者將導(dǎo)致方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移中性能指標(biāo)的選取過于武斷或模糊；另有觀點認(rèn)為應(yīng)根據(jù)具體實施中一些操作模式變異（format variation）所造成的風(fēng)險來選擇方法性能指標(biāo)的確證，該觀點在理論上較為可行，但在實際中如何嚴(yán)謹(jǐn)有效地選擇評價指標(biāo)并達(dá)成共識，仍然是值得深入探討的問題。作者結(jié)合近年來的方法學(xué)研究進(jìn)展［1-21］，概括出如下3 個方面的重要進(jìn)展。 1.1 推薦采用方法總變異度指標(biāo) 無論是含量測定方法（Ⅰ類方法）還是定量雜質(zhì)分析方法（Ⅱa 類方法），建議對準(zhǔn)確度和精密度采用聯(lián)合考察的方式，即通過計算方法的總變異度（total variability）（或叫總誤差total error）的方式。該方式改變目前割裂完整設(shè)計的確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移實驗操作方式（即實驗設(shè)計方案），并且對方法在實驗室內(nèi)部的持續(xù)確認(rèn)或向新實驗室的轉(zhuǎn)移尤為重要且便利。其理由：（A）方法的檢測能力評估是對方法總變異度的評價，而方法總變異即為準(zhǔn)確度和精密度的合成（見“3.2 項”）；（B）對準(zhǔn)確度和精密度的聯(lián)合評估，也可以更精準(zhǔn)地表達(dá)出所確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移的方法線性和范圍是否達(dá)到驗證時的要求。作者建議實驗人員采用相同或同類儀器和同批次的試劑，設(shè)置驗證實驗中確立的濃度范圍的實驗設(shè)計方案進(jìn)行確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移，最后利用方法驗證中獲得的預(yù)測區(qū)間、容忍區(qū)間和方法能力指數(shù)作為考察參數(shù)［14，19］（見“3.1”項），或通過綜合考察方法的變異和方法檢測報告值（檢測結(jié)果）的可靠范圍，使之對方法性能的評價結(jié)果更具可靠性。 1.2 推薦使用線性回歸的預(yù)測下限指標(biāo) 在雜質(zhì)檢查過程中應(yīng)該對檢測下限（LOD）和定量下限（LOQ）進(jìn)行考察，現(xiàn)ICH Q2（R1）等法規(guī)推薦了多種方式進(jìn)行LOD 和LOQ 的確定，然而，USP <1210> 經(jīng)過充分論證，建議采用上述實驗設(shè)計過程獲得的線性預(yù)測下限作為LOD［14］，這被認(rèn)為更具科學(xué)可靠性。 1.3 無需對專屬性進(jìn)行考察 確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移過程是對經(jīng)驗證過的方法的性能進(jìn)行考察，檢測方法所對應(yīng)的產(chǎn)品已經(jīng)被充分確證，故專屬性對定量檢測方法不是考察重點（非鑒別類方法）。無論確認(rèn)或轉(zhuǎn)移，都是用自身屬性一致的樣品進(jìn)行確證（confirmation）［9］，所以在檢測時可以同時進(jìn)行確證過程，無需再重點考察專屬性。即使檢測中分離度上有一定差異，通過標(biāo)準(zhǔn)對照，也是完全可以保證產(chǎn)品專屬性的。當(dāng)方法的使用范圍擴(kuò)大時，產(chǎn)品本身需要進(jìn)行再驗證，而非確認(rèn)或轉(zhuǎn)移的內(nèi)容。 2 方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移與驗證方案的異同 前面已經(jīng)提到方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移的實驗設(shè)計方案可以同時考察準(zhǔn)確度、精密度、線性和范圍，但它與方法驗證的方案不完全相同。在方法驗證階段，需要對實驗人員、儀器和主要試劑等主要變異源進(jìn)行多因素的全面聯(lián)合評價，屬于多因素的正交設(shè)計或嵌套設(shè)計。而方法確認(rèn)或轉(zhuǎn)移，不需要再進(jìn)行這種全面的多因素設(shè)計，僅需實驗人員在規(guī)定條件下獨立重復(fù)即可達(dá)到確認(rèn)評估目的[本文由藥研公眾號整理排版]。 3 方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移成功的標(biāo)準(zhǔn) 判斷方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移是否成功是確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移要回答的核心問題，也是最常困擾檢測實驗室的問題。目前國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH）和《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）等標(biāo)準(zhǔn)，也很少談及相應(yīng)的原則。通常情況下實驗室會根據(jù)實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行求方法性能指標(biāo)的均值、（相對）偏差和精密度等，并通過差異性檢驗判斷檢測結(jié)果是否達(dá)到設(shè)定的預(yù)期結(jié)果［10］，但這種差異性檢驗方式會增加誤判的風(fēng)險并導(dǎo)致缺陷。 為了保證方法確認(rèn)和轉(zhuǎn)移過程判斷標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性、嚴(yán)謹(jǐn)性和結(jié)論可靠性，作者建議在方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移中使用等效區(qū)間的比較方式作為（確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移）成功與否的判定依據(jù)。 3.1 建議用等效檢驗方式作為判定標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)方法檢測的報告值所在的等效區(qū)間（包含預(yù)測區(qū)間和容忍區(qū)間）方式，可更好地回答方法檢測能力是否等效的問題［14］。USP <1210> 在方法驗證時給出報告值的預(yù)測區(qū)間（prediction interval）和容忍區(qū)間（tolerance interval）進(jìn)行判定，可以更直觀且有效地判定確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移時方法能力是否滿足其實際用途。所謂預(yù)測區(qū)間，是指用驗證試驗的樣本結(jié)果來預(yù)計在一定置信水平下，下一次或下幾次實驗時，該方法所測結(jié)果的范圍［14-18］。其公式為： 方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移作為方法生命周期中的持續(xù)驗證的過程，可以看作是方法驗證中的后續(xù)一次實驗應(yīng)得到的結(jié)果波動區(qū)間，故可以把方法驗證報告值（或估計值）的預(yù)測區(qū)間作為確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移是否成功的標(biāo)準(zhǔn)（通常應(yīng)該在該范圍內(nèi)）。如果確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移的實驗結(jié)果（報告值）超出方法驗證所得報告值的容忍區(qū)間，則可以肯定其確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移不成功。若所測結(jié)果在預(yù)測區(qū)間和容忍區(qū)間范圍內(nèi)時，應(yīng)關(guān)注確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移中的改進(jìn)問題。 3.2 推薦用方法能力指數(shù)作為判定標(biāo)準(zhǔn)
公式中，USL 為特性量值（檢測指標(biāo)）限度標(biāo)準(zhǔn)的上限，LSL 為特性量值限度標(biāo)準(zhǔn)的下限，σmethod 為方法總變異，SDmethod 為樣本變異或樣本標(biāo)準(zhǔn)差。方法能力指數(shù)在1.0 以上時，表明該方法在實際應(yīng)用時，發(fā)生誤判的概率低于0.27%［19］。 預(yù)測區(qū)間、容忍區(qū)間和方法能力指數(shù)這3 個參數(shù)綜合考慮了方法的總變異度、報告值的區(qū)間范圍和與對應(yīng)產(chǎn)品限度標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系，能夠更真實、直觀、科學(xué)地描述方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移過程中的方法能力是否滿足其預(yù)期用途。 3.3 實例分析 本示例引用《含量測定類方法驗證中的統(tǒng)計學(xué)評價》［20］中獲得的方法能力評價表（見表1）數(shù)據(jù)，對新方法性能評估參數(shù)在方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移是否成功進(jìn)行判定的舉例說明。
從表1 可見，在90.0%~110.0% 的范圍內(nèi)，其方法總變異最大者在110.0% 濃度下，為0.78%，預(yù)測區(qū)間為99.52%~101.63%，容忍區(qū)間為98.93%~102.22%；這時的方法能力指數(shù)為4.28，說明該方法導(dǎo)致的誤判率可以忽略不計［21］，完全滿足檢測需要。如果在方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移中，各濃度點的檢測結(jié)果在99.52%~101.63% 預(yù)測區(qū)間范圍內(nèi)，則認(rèn)為該方法的確認(rèn)或轉(zhuǎn)移成功（圖1-A 區(qū)域）；如果其檢測結(jié)果超出98.93%~102.22% 的容忍區(qū)間范圍，則認(rèn)為方法確認(rèn)或轉(zhuǎn)移失敗（圖1-C 區(qū)域）；如果其檢測結(jié)果介于98.93%~99.52% 或101.63%~102.22% 的預(yù)測區(qū)間和容忍區(qū)間范圍之間，則應(yīng)引起確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移實驗者的注意（圖1-B 區(qū)域）。
4 討論 4.1 方法性能的持續(xù)評估是藥品領(lǐng)域研究的熱點。 2000 年ICH 發(fā)布的Q7A［5］首次提出了方法確認(rèn)的概念并將其與方法驗證進(jìn)行區(qū)別，隨后USP 相繼發(fā)布了USP 通則<1224>［1］、<1226>［3］主要針對方法轉(zhuǎn)移和方法確認(rèn)進(jìn)行討論，歐洲藥品質(zhì)量控制實驗室聯(lián)盟（OMCL）［8］、美國分析化學(xué)家協(xié)會（AOAC）［9］、ISO［6］等組織也發(fā)表了有關(guān)方法確認(rèn)和轉(zhuǎn)移的指導(dǎo)原則和法規(guī)。2017 年我國發(fā)布了《GB/T 27417—2017 合格評定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》［7］。以上法規(guī)和指導(dǎo)原則對方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移成功的標(biāo)準(zhǔn)表述的不夠明確或缺乏科學(xué)的可操作性，導(dǎo)致質(zhì)量控制人員在實際工作中常被判定準(zhǔn)則所困擾。結(jié)合最新研究進(jìn)展，特別是USP<1210>［14］和文獻(xiàn)《判斷定量類理化分析方法滿足預(yù)期用途的標(biāo)準(zhǔn)探討》［19］，為今后方法確認(rèn)和轉(zhuǎn)移的判定標(biāo)準(zhǔn)提供了新思路。 4.2 方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移的評估依賴于方法驗證。 目前國內(nèi)有關(guān)方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移的指導(dǎo)原則中，通常是簡單比較結(jié)果的平均值和偏差（例如中間精密度的計算），以此作為對方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移成功判定的評價參數(shù)［10］，這種方式未從整體體現(xiàn)方法的變異，也沒有直接回答方法是否滿足其預(yù)期用途。《中國藥典》目前采用對準(zhǔn)確度和精密度單獨考察的方式，割裂了二者之間的關(guān)聯(lián)，無法準(zhǔn)確地對方法的性能是否滿足其預(yù)期用途進(jìn)行判斷；本文采用預(yù)測區(qū)間、容忍區(qū)間和MCI 這些參數(shù)作為方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移的評估標(biāo)準(zhǔn)，可更全面地了解方法的性能。這種方式首先要求在方法驗證階段能按照改進(jìn)的驗證設(shè)計方案和統(tǒng)計計算方法，提供這些參數(shù)并予以公開報告，該方式目前看似復(fù)雜，但實際上可明顯簡化后續(xù)方法的確認(rèn)和轉(zhuǎn)移。這一改變對今后方法驗證工作模式提出新要求、新挑戰(zhàn)。相信隨著研究人員的持續(xù)論證和ICH 等組織對方法評估新理念的不斷吸收，今后會對方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移工作提供更科學(xué)、簡便直接的判定方法。 4.3 實驗設(shè)計對獲取穩(wěn)健可靠的方法性能參數(shù)非常重要。 無論在方法驗證中，還是在方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移中，正確合理的試驗方案對獲取穩(wěn)健可靠的方法性能參數(shù)以及實驗最終結(jié)果都是至關(guān)重要的。方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移的設(shè)計方案可基于方法驗證階段提出的實驗方案進(jìn)行后續(xù)操作，所以說嚴(yán)謹(jǐn)可靠的實驗方案涉及到產(chǎn)品整個方法學(xué)的建立。目前采用單獨考察準(zhǔn)確度、精密度的方式割裂了完整的實驗設(shè)計方案，進(jìn)而無法從整體體現(xiàn)方法的變異，使實驗結(jié)果在統(tǒng)計學(xué)中有顯著性差異，卻不具有現(xiàn)實意義，導(dǎo)致判斷依據(jù)不足，誤判風(fēng)險增大，結(jié)論不可靠。而USP<1210>［14］中所提出的聯(lián)合評估方法的準(zhǔn)確度與精密度的方式與上述僅考察單個因素的變異不同，該方式運用了多因素方差分析的原理，對方法進(jìn)行更全面的掌控，使結(jié)論更科學(xué)可靠，也正是本文探討方法確認(rèn)和轉(zhuǎn)移的理論基礎(chǔ)。 4.4 方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移需要充分應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)。 應(yīng)用預(yù)測區(qū)間、容忍區(qū)間、方法能力指數(shù)等新參數(shù)進(jìn)行方法學(xué)的計算，與過去僅計算準(zhǔn)確度和精密度方式對比更為復(fù)雜。這也是目前上述新參數(shù)難以推廣使用的主要原因。要準(zhǔn)確理解并使用該方式，需要實驗人員了解掌握相關(guān)統(tǒng)計學(xué)概念，并找到合適的統(tǒng)計工具進(jìn)行分析。隨著現(xiàn)代統(tǒng)計學(xué)工具的普及［22］，該問題將不再成為使用者的困擾。 5 結(jié)語 制定出一套科學(xué)完備的確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移評價標(biāo)準(zhǔn)，能推動方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移有效發(fā)展，幫助質(zhì)量控制人員更好地完成方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移工作非常重要。采用本文提出的方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移實驗設(shè)計，通過實驗的報告值與方法驗證所獲方法的總變異、預(yù)測區(qū)間和容忍區(qū)間相比較，或者計算其方法能力指數(shù)的方式作為方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移是否成功的標(biāo)準(zhǔn)，可更真實、直觀、科學(xué)地描述方法確認(rèn)/ 轉(zhuǎn)移過程中的方法能力是否滿足其預(yù)期用途[本文由藥研公眾號整理排版]。
采用方法能力指數(shù)的方式［19］可直觀地確定所確認(rèn)或轉(zhuǎn)移的方法在具體使用中的誤判風(fēng)險。方法能力指數(shù)（method capability index，MCI）是反映方法能力滿足方法預(yù)期要求的能力指數(shù)。其公式為：
