緩沖液的選擇

當分離酸性或堿性樣品時，通常需加入一定量的緩沖鹽，緩沖鹽的濃度及類型如何確定？

1、緩沖鹽的濃度

緩沖鹽的濃度對離子樣品保留值的影響通常較小，濃度一般為10-50mmol/l。

2、緩沖鹽的類型

緩沖鹽類型的選擇，主要取決于所需要的緩沖能力，在反向色譜中，流動相中水相的pH和離子強度在開發對條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對于離子型化合物，典型的樣品的保留隨pH改變而明顯變化。通常在pH2到4條件下，保留時間對pH的微小改變穩定性最高。因此建議將這一pH范圍作為大多數樣品方法開發的起始pH，包括堿性化合物和一般的弱酸。緩沖鹽溶液的pH值越接近其pka，緩沖能力越強。一般緩沖鹽溶液的pH值應在其pka±1的范圍內。

3、緩沖鹽的離子締合（反離子對液相色譜行為的影響與理論解析）

如酸性條件下分離堿性化合物，加入NH4CL，堿性物質離子與反離子相互作用的平衡導致它們相互的溶劑化并形成相關復合物離子：

[堿]+[Cl]− = [堿+ -- Cl−]，在低pH時，堿性化合物被完成質子化，溶液陰離子（如CL-）在流動相中破壞了堿性物周圍的水分子并增加其疏水性，導致樣品保留時間增加，當鹽濃度大于50mM時，保留時間略有下降[4]，這可能是飽和反離子CI-引起的離子相互作用的屏蔽作用。此外還可以添加硫酸鈉或者高氯酸鈉等改變堿性化合物的保留。

4.緩沖鹽的其它性質

緩沖鹽的溶解性、揮發性和穩定性（可能與設備、樣品和或色譜柱發生作用）對某些分離也很重要。如磷酸鹽，在含有高濃度有機相（70%以上），可能會析出；一些緩沖劑放置即降解，貯存或長期使用后其紫外吸收會增加（如：TFA、三乙胺）；一些緩沖鹽能通過形成離子對，對樣品發生作用（如三氟醋酸緩沖劑與陽離子樣品，三乙胺與陰離子樣品等）；揮發性的緩沖鹽如碳酸胺、甲酸銨、醋酸銨等可應用于蒸發光散射、質譜的檢測。

5.pH的選擇

通常進行分析方法開發時要求遠離化合物的pKa，是遠離主成分的pKa還是遠離待測雜質的pKa？如果在pKa附件是否方法就不能用？

是各雜質的pKa，只不過平時經常是通過主成分的pKa來代表各雜質，制定遠離pKa±2。pKa為化合物的酸堿平衡常數，即在該pH條件下，該化合物處于分子離子狀態，分子狀態化合物，疏水性較強，即色譜柱保留時間較長；離子狀態化合物親水性較強，及色譜柱保留時間較短。制定的流動相pH在待測組分pKa±2以內，有時也是可用的，只不過可能存在各雜質的色譜行為對pH較敏感，尤其是保留時間。會不會出現裂縫或出現雙峰的現象，個人認為通常不會，因為分子離子間也存在相互作用力，除非分子疏水作用、離子的親水作用大于分子離子間的作用力，才有可能裂縫/出雙峰。

6.通常開發方法建議在低pH進行

大多數反相柱都可以在pH2-8條件下使用，強酸條件下硅膠基質發生水解，造成塌陷。高pH 條件下硅膠會溶解，當然硅膠柱經特殊處理，如硅甲基嵌入、增加亞乙基橋等可以增強填料的耐酸堿性。對于一般酸堿化合物的分離，建議先從酸性條件起步，無法達到目的后再向中性、堿性條件進行嘗試（應注意色譜柱的耐受性）。

7.調節pH的應用及注意事項

1、當pH改變時，有些酸性或堿性樣品的吸光度會發生改變（因為紫外吸收會有溶劑效應，紅移或藍移），故在不同pH值時運行的已知化合物無法保持其峰大小不變。分析方法開發時，通常采用“混標”進行分離度摸索，無法采用峰高進行標識時，檢測采用全波長進行峰的定位（采用光電二極管陣列檢測器）。

2、pH變化可導致離子化合物的k值發生10倍或更大的變化，根據需要對流動項（B%）進行調整。

3、在分離一組酸堿官能團相似的化合物時，通過改變pH來優化分離度是個不錯的選擇，但需權衡方法的抗干擾性，如pH的微小變化（小于0.1單位）導致峰保留的變化（pH接近一種或多種化合物的pKa），可通過精確量取緩沖劑組成（重量或體積）以精密控制pH值，而不是用pH計將緩沖劑滴定至理想的pH，日常方法開發，盡量避免該條件，方法耐受性非常差，風險極大。

4、偏中性條件硅羥基對弱堿性化合物的影響，對于堿性化合物會與其形成吸附，導致拖尾，解決辦法分別為更換色譜柱、用高濃度的緩沖鹽（>10mM），選擇被硅羥基牢固保留的緩沖鹽陽離子（Na+<k+<nh4+<三乙胺+）。< p=""></k+<nh4+<三乙胺+）。<>

5、偏中性條件硅羥基對電負性強的化合物的影響（比溶劑出峰還靠前），一個案例，有一雜質在中性色譜條件下，在溶劑前出峰，調整該方法流動相至酸性條件，該雜質在色譜柱上有保留。

6、在混合磷酸三乙胺或醋酸三乙胺時，應先加入磷酸鹽或醋酸鹽然后再加三乙胺，因為純三乙胺可能不溶于水。在用醋酸銨/甲酸銨控制pH時，由于該鹽吸濕性較強，需確定不同摩爾濃度對分離的影響。確保方法的適用性。

甲醇/乙腈的選擇

反向色譜最常用的甲醇或乙腈，甲醇的截至波長為205nm，乙腈的截至波長為190nm，乙腈水系統由于其粘度非常低，塔板數較高而柱壓較低，是流動相的最佳選擇。通常40%的乙腈具有與50%的甲醇相似的溶劑強度。

基于溶劑不同的選擇性，甲醇為類質子溶劑，可形成氫鍵，對于分離酸堿或電負性強的化合物有提高選擇性，乙腈為極性分子，其碳氮三鍵含有未成鍵電子，能與含有空軌道的化合物結合，則與甲醇有著不同的化合物選擇性。有時單用ACN或MEOH可能會達不到理想的分離效果，在流動相同時使用ACN和MEOH可改變選擇性以獲得較好的分離效果。簡言之，在改變分離選擇性的時候，甲醇細調，乙腈粗調。主要是為了調整流動相的粘度和強度，使得分離效果和選擇性有所改善。

離子對的選擇

適用范圍：使用液相色譜法分析電離能力比較強的樣品時，樣品在反相色譜柱上的保留時間很短或者根本不保留，這時要加入相應的離子對試劑，將分析物上的離子進行結合，形成在柱子上有保留的分子。

作用原理：加入離子對試劑后，它可以與待分析的物質（多為在溶液狀態時顯以與離子對試劑相反的電荷）結合成離子對而呈中性，疏水性增加而在色譜柱上有保留行為。離子對類似于膠黏劑，一頭以離子吸引住待測物（也是離子），另一頭以碳鏈與固定性作用，從而把待測物保持在固定相上。

試劑選擇：離子對分為正離子對和負離子對，分析酸性樣品（確切的說應該是作用基團）用正離子對試劑，分析堿性樣品用負離子對試劑。正離子對試劑可以吸附帶負電荷的樣品組分，負離子對試劑反之。戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉.....十二烷基磺酸鈉屬于負離子對試劑；四丁基溴化銨、四丁基硫酸氫銨、四丁基氫氧化銨等屬于正離子對試劑。離子對要考慮樣品體系的復雜性和干擾物的特性，先用碳鏈短的，濃度盡量低，降低對色譜柱填料的影響，同時流動相的pH值盡可能低以確保離子化程度。

離子對試劑的濃度：通過改變被固定相吸附的離子對試劑的多少，有可能將保留過程由反相改變為離子交換色譜。這種改變是通過改變流動相中的試劑的濃度實現的。同常濃度范圍從幾毫摩到幾十毫摩不等。

注意事項：三乙胺、醋酸銨也起到部分離子對試劑的作用，使用離子對的色譜柱建議專柱專用。

等度與梯度的選擇

梯度洗脫用于方法建立，對于組分未知的樣品進行HPLC方法建立時，即使最終分離擬用等度洗脫仍需先采用梯度洗脫進行方法開發。目的為確定以下幾項：

1、初始梯度洗脫分離可以近似估計出樣品的保留值范圍，為后續試驗選擇等度或梯度提供必要的依據。

2、若等度洗脫是最好選擇，初始梯度試驗可為進一步試驗提供最佳%B的估算值。

3、初始梯度洗脫實驗可以使整體樣品分離更好、更快。

4、初始梯度洗脫遺漏早與晚流出的低濃度組分的可能性較小。

5、初始梯度通常為線性梯度（全梯度），如5—100%B，根據雜質情況，1.5梯度/min或5梯度/min，進行試驗。

     梯度洗脫時由于改性劑在水相的吸收與有機相中的吸收不同，導致基線漂移，可通過混合流動相的方式進行改善。