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第一法 金黃色葡萄球菌定性檢驗
·樣品的處理
稱取25g樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯無菌均質杯內，8000r/min~10000r/min均質1min~2min,或放入盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1min~ 2min。若樣品為液態,吸取25mL樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯的無菌錐形瓶(瓶內可預置適當數量的無菌玻璃珠)中,振蕩混勻。
·增菌
將上述樣品勻液于36 ℃±1 ℃培養18h~24h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁 生長。
·分離
將增菌后的培養物,分別劃線接種到 Baird-Parker平板和血平板,血平板36 ℃±1 ℃培養18h~ 24h。Baird-Parker平板36 ℃±1 ℃培養24h~48h。
·初步鑒定
金黃色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上呈圓形,表面光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為2mm~3mm, 顏色呈灰黑色至黑色,有光澤,常有淺色(非白色)的邊緣,周圍繞以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰 帶。當用接種針觸及菌落時具有黃油樣黏稠感。有時可見到不分解脂肪的菌株,除沒有不透明圈和清 晰帶外,其他外觀基本相同。從長期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落,其黑色常較典型菌落淺些, 且外觀可能較粗糙,質地較干燥。
在血平板上,形成菌落較大,圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色(有時為白色),菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述可疑菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。
·確證鑒定
1.染色鏡檢:金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌,排列呈葡萄球狀,無芽胞,無莢膜,直徑約為 0.5μm~1 5 μm。
2.血漿凝固酶試驗:挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5個可疑菌落(小于5個全選),分別接 種到5mLBHI和營養瓊脂小斜面,36 ℃±1 ℃培養18h~24h。
取新鮮配制兔血漿0.5 mL,放入小試管中,再加入 BHI培養物0.2 mL~0.3 mL,振蕩搖勻,置 36 ℃±1 ℃溫箱或水浴箱內,每半小時觀察一次,觀察6h,如呈現凝固(即將試管傾斜或倒置時,呈現 凝塊)或凝固體積大于原體積的一半,被判定為陽性結果。同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌 菌株的肉湯培養物作為對照。也可用商品化的試劑,按說明書操作,進行血漿凝固酶試驗。結果如可疑,挑取營養瓊脂小斜面的菌落到5mLBHI,36 ℃±1 ℃培養18h~48h,重復試驗。
結果判定:符合4、5,可判定為金黃色葡萄球菌。
結果報告：在25g(mL)樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。
1.7.5%氯化鈉肉湯增菌培養：
（1）若樣品本身在均質后清澈，培養18h觀察呈現一定程度的渾濁（與培養前相比），則接種平板；若18h后仍無變化，繼續培養至24h后無論渾濁與否都接種至平板；
（2）若樣品本身在均質后渾濁，則直接培養至24h后再接種平板。
2.血平板：36±1℃培養18h后觀察，若有菌落生長或有菌落生長的跡象（無論是否溶血），則應酌情配制NA、BHI并分裝至小試管中（NA 10mL/管、BHI 5mL/管）、滅菌后NA應斜放凝固成瓊脂斜面備用。至血平板培養至24h取出，挑取菌落進行革蘭氏染色鏡檢，同時挑取菌落接種至NA斜面、BHI肉湯管，36±1℃培養24h。
3.接種原則：
（1）革蘭氏染色后還剩余10個或10個以上菌落，則NA、BHI分別接種5管；
（2）若多于5個（不包括5個）不足10個，則BHI接種5管，剩余的接種NA；
（3）5個及以下則全部接種BHI，不接種NA。
4.BP平板：
36±1℃培養24h后觀察，有菌落生長則取出，無菌落生長則繼續培養至48h后再觀察。若血平板已挑取菌落進行證實試驗，則不必再挑取BP平板上的菌落進行實驗。若血平板上無菌落生長，則應在24h～48h內逐步觀察BP平板是否長菌或有無長菌跡象，有則需配置BHI及NA，挑取BP上的菌落進行純化、增菌，36±1℃培養24h。
5.血漿凝固酶試驗：
（1）根據BHI管數，取凍干血漿粉，每瓶用移液槍加入0.5mL生理鹽水，使其充分溶解，再換移液槍槍頭取0.3mLBHI培養物加入其中（每管BHI用1個槍頭），振蕩搖勻后于36±1℃培養，計時，每30min觀察一次，如呈現凝固（將試管傾斜或倒置時出現凝塊）或半凝固（一般的液體呈現凝固）則判定為陽性。若一直不凝固，則一直觀察，直至觀察至6h（查看12次）還未凝固，則試驗終止，判定為陰性結果；若中途出現完全凝固或半凝固，則試驗終止，判定為陽性結果。
（2）同時取金黃色葡萄球菌標準菌株（ATCC 6538以及CMCC（B）26003各一支）制成菌懸液后作為陽性對照、以滅菌生理鹽水為陰性對照，分別接種至BHI中同步培養后進行血漿凝固酶試驗。
（3）若血漿凝固酶試驗結果可疑，則挑取NA上的菌落接種BHI再次進行試驗。
第二法 金黃色葡萄球菌平板計數法
·樣品的稀釋
1.固體和半固體樣品:稱取25g樣品置于盛有225mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯 內,8000r/min~10000r/min均質1min~2min,或置于盛有225mL稀釋液的無菌均質袋中,用拍 擊式均質器拍打1min~2min,制成1∶10的樣品勻液。
2.液體樣品:以無菌吸管吸取25mL樣品置于盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形 瓶(瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)中,充分混勻,制成1∶10的樣品勻液。
3.用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注于盛有9mL磷酸鹽 緩沖液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用1支1mL 無菌吸管反復吹打使其混合均勻,制成1∶100的樣品勻液。
4.按3操作程序,制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次,換用1次1mL無菌吸管或 吸頭。
·樣品的接種
根據對樣品污染狀況的估計,選擇2個~3個適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),在進 行10倍遞增稀釋的同時,每個稀釋度分別吸取1mL樣品勻液以0.3mL、0.3mL、0.4mL接種量分別 加入三塊 Baird-Parker平板,然后用無菌涂布棒涂布整個平板,注意不要觸及平板邊緣。使用前,如 Baird-Parker平板表面有水珠,可放在25 ℃~50 ℃的培養箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。
·培養
培養 在通常情況下,涂布后,將平板靜置10min,如樣液不易吸收,可將平板放在培養箱36 ℃±1 ℃培 養1h;等樣品勻液吸收后翻轉平板,倒置后于36 ℃±1 ℃培養24h~48h。
·典型菌落計數和確認
1.金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圓形,表面光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為 2 mm~ 3mm,顏色呈灰黑色至黑色,有光澤,常有淺色(非白色)的邊緣,周圍繞以不透明圈(沉淀),其外常有一 清晰帶。當用接種針觸及菌落時具有黃油樣黏稠感。有時可見到不分解脂肪的菌株,除沒有不透明圈 和清晰帶外,其他外觀基本相同。從長期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落,其黑色常較典型菌落淺 些,且外觀可能較粗糙,質地較干燥。
2.選擇有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板,且同一稀釋度3個平板所有菌落數合計在20CFU~ 200CFU 之間的平板,計數典型菌落數。
3.從典型菌落中至少選5個可疑菌落(小于5個全選)進行鑒定試驗。分別做染色鏡檢,血漿凝固酶試驗;同時劃線接種到血平板36℃±1℃培養18h~24h后觀察菌落形態,金黃色葡萄球菌 菌落較大,圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色(有時為白色),菌落周圍可見完全透明溶血圈。
1.若只有一個稀釋度平板的典型菌落數在20CFU~200CFU 之間,計數該稀釋度平板上的典型菌落,按式(1)計算。
2.若最低稀釋度平板的典型菌落數小于20CFU,計數該稀釋度平板上的典型菌落,按式(1)計算。
3.若某一稀釋度平板的典型菌落數大于200CFU,但下一稀釋度平板上沒有典型菌落,計數該稀釋 度平板上的典型菌落,按式(1)計算。
4.若某一稀釋度平板的典型菌落數大于200CFU,而下一稀釋度平板上雖有 典型菌落但不在20CFU~200CFU 范圍內,應計數該稀釋度平板上的典型菌落,按式(1)計算。
5. 若2個連續稀釋度的平板典型菌落數均在20CFU~200CFU 之間,按式(2)計算。
計算公式
根據上面的公式計算結果,報告每g(mL)樣品中金黃色葡萄球菌數,以 CFU/g(mL)表示;如T 值為 0,則以小于1乘以最低稀釋倍數報告。
1.取1mL樣品稀釋勻液接種3個BP平板（此處并未嚴格按照標準中0.3mL、0.3mL、0.4mL精確取樣，由于如此操作會增加試驗時間，無法在15min內完成試驗）。
2.涂布時不要觸及平板邊緣（會導致樣液涂抹不均勻，大部分匯集于邊緣）。
3.可用同一根涂布棒從低稀釋度到高稀釋度進行涂布（不用換涂布棒）。
4.涂布完成后應稍微放置一段時間使培養基吸收樣品勻液。
5.若水珠較多，可正置于培養箱中1～2h后再倒置培養。
6.36±1℃培養24h后觀察，有典型菌落生長則進行證實試驗（革蘭氏染色鏡檢、血漿凝固酶試驗、劃線血平板）。若無菌落生長則繼續培養至48h后再觀察，有典型菌落生長則進行證實試驗，無典型菌落生長則試驗終止。
第三法 金黃色葡萄球菌MPN計數法
同第二法
1.根據對樣品污染狀況的估計,選擇3個適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),在進行 10倍遞增稀釋的同時,每個稀釋度分別接種 1 mL 樣品勻液至 7.5% 氯化鈉肉湯管(如接種量超過 1mL,則用雙料7.5%氯化鈉肉湯),每個稀釋度接種3管,將上述接種物36℃±1℃培養,18h~24h。
2.用接種環從培養后的7.5%氯化鈉肉湯管中分別取培養物1環,移種于Baird-Parker平板36℃ ±1 ℃培養,24h~48h。
同第二法
根據證實為金黃色葡萄球菌陽性的試管管數,查MPN檢索表,報告每g(mL)樣品中金黃色葡萄球菌的最可能數,以 MPN/g(mL)表示。
1、樣品稀釋同菌落總數，取3個連續稀釋度稀釋液（或包括液體樣品原液），每個稀釋度接種3管7.5%氯化鈉肉湯，每管接種1mL，36±1℃培養18h后觀察，若出現渾濁則接種至BP平板，若無變化則繼續培養至24h后再接種至BP平板。
2、劃線接種至BP平板，36±1℃培養24h后觀察，有典型菌落生長則進行證實試驗（革蘭氏染色鏡檢、血漿凝固酶試驗、劃線血平板）。若無菌落生長則繼續培養至48h后再觀察，有典型菌落生長則進行證實試驗，無典型菌落生長則試驗終止。
3、根據證實后的陽性管數差MPN表得出結果。
