手機版
微生物檢驗中常用的生化反應有：
(一)糖酵解試驗
各種微生物因含有不同的分解糖(醇、苷)類的酶，所以分解糖類的能力各不相同，而且分解相應糖類后形成的終末產物亦隨細菌種類而異，有的產酸，有的還可以產生氣體，因此可作為鑒別細菌的依據，對腸道桿菌的鑒別尤為常見。可用指示劑及發酵管檢驗。
試驗方法：以無菌操作，用接種針或環移取純培養物少許，接種于發酵液體培養基魯，若為半固體培養基，則用接種針作穿刺接種。接種后，置36℃ ±1.0 ℃培養，每天觀察結果，檢視培養基顏色有無改變（產酸），小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產氣陽性，若為半固體培養基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時還可看出接種菌有無動力，若有動力，培養物可呈彌散生長。
本試驗主要是檢查細菌對各種糖、醇和糖苷等的發酵能力，從而進行各種細菌的鑒別，因而每次試驗，常需同時接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫、溴百里藍和An-drade指示劑。
(二)淀粉水解試驗
某些細菌可以產生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。
試驗方法：以18h~24h的純培養物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個平板可分區接種，試驗數種培養物）或直接移種于淀粉肉湯中，于36℃ ±1 ℃培養24 h ~48 h,或于20℃培養5d。然后將碘試劑直接滴浸于培養基表面，若為液體培養物，則加數滴碘試劑于試管中。立即檢視結果，陽性反應（淀粉被分解）為瓊脂培養基呈深藍色、菌落或培養物周圍出現無色透明環、或肉湯顏色無變化。陰性反應則無透明環或肉湯呈深藍色。
淀粉水解系逐步進行的過程，因而試驗結果與菌種產生淀粉酶的能力、培養時間、培養基含有淀粉量和pH等均有一定關系。培養基pH必須為中性或微酸性，以pH7. 2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時制備為妥。
(三) V-P試驗
某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養基中能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環境下，被空氣中的氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V-P（+）反應。
1.O'Meara氏法
將試驗菌接種于通用培養基，于36 ℃ ±1 ℃培養48 h,培養液1 mL加O‘Meara試劑（加油0.3%肌酸或肌酸酐的40%氫氧化鈉水溶液)1mL，搖動試管1min~2min，靜置于室溫或36 ℃ ±1 ℃恒溫箱，若4h內不呈現伊紅即判定為陰性。亦有主張在48 ℃-50 ℃水浴放置2h后判定結果者。
2. Barritt氏法
將試驗菌接種于通用培養基，于36℃±1℃培養4d,取培養液2.5 mL先加入5%α-萘酚純酒精溶液0.6%mL，再加40%氫氧化鉀水溶液0.2mL，搖動2min~5min，陽性菌常立即呈現紅色，若無紅色出現，靜置于室溫或36℃±1℃恒溫箱，如2h內仍不顯現紅色可判定為陰性。
3.快速法
將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中，挑取產酸反應的三糖鐵瓊脂斜面培養物一接種環，乳化接種于其中，加入5% a-萘酚3滴， 40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動后放置5min,判定結果。不產酸的培養物不能使用。
本試驗一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽孢桿菌和葡萄球菌等其他細菌時，通用培養基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基甲醇的產生，故應省去或以氯化鈉代替。本試驗常與甲基紅試驗一起使用。本試驗陽性，甲基紅試驗陰性，反之亦然。
(四) 甲基紅試驗
大腸桿菌科各菌屬都能發酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產生丙酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產生乳酸、琥珀酸、乙酸和甲酸等大量酸性產物，可使培養基pH下降至4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。
試驗方法：挑取新的待試純培養物少許，接種于通用培養基，培養于36℃±1℃或30℃(以30℃較好)3d-5d,從第二天起，每日取培養液1mL,加甲基紅指示劑1~2滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發現陽性或至第5天仍為陰性即可判定結果。
甲基紅為酸性指示劑， pH范圍為4.4-6.0,其pH為5.0,故在pH5.0以下，隨酸度增加而紅色增強，在pH5.0以上，則隨堿度增加而黃色增強，在pH5.0或上下接近時，可能變色不夠明顯，此時應延長培養時間，重復試驗。
(五)靛基質試驗
某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。
試驗方法：將待試純培養物小量接種于試驗培養基管，于36℃±1 ℃培養24h后，取約2mL培養液，加入Kovacs氏試劑2滴~3滴，輕搖試管，呈紅色為陽性；或先加少量乙醚或二甲苯，搖動試管以提取和濃縮靛基質，待其浮于培養液表面后，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數滴，在接觸面呈紅色，即為陽性。
實驗證明靛基質試劑可與17種不同的靛基質化合物作用而產生陽性反應，若先用二甲苯或乙醚等進行提取，再加試劑，則只有靛基質或5-甲基靛基質在溶劑中呈現紅色，因而結果更為可靠。
(六)硝酸鹽還原試驗
有些細菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。
1.試驗方法
臨試前將試劑的A (磺胺酸冰乙酸溶液)和B(a-萘胺乙醇溶液)試液各0.2mL等量混合，取混合試劑約0.1mL,加于液體培養物或瓊脂斜面培養物表面，立即或于10min內呈現紅色即為試驗陽性，若無紅色出現則為陰性。
用a-萘胺進行試驗時，陽性紅色消退很快，故加入后應立即判定結果。進行試驗時必須有未接種的培養基管作為陰性對照。a-萘胺具有致癌性，故使用時應加注意。
2.試驗方法
將含有0.02%-0.2%硝酸鉀的蛋白胨水分裝至試管中，每支試管預先放一個倒置的發酵管，然后在121℃高壓滅菌15min。按肉湯培養基方法接種，連同已滅菌的對照管一起在最佳生長溫度培養2d-7d,在接種管和對照管中加上Griess Ilosvay試劑1 mL或亞硝酸鹽試紙，幾分鐘內出現紅色表明亞硝酸鹽產生。對照管應為微紅色或無色。
陰性結果應進行確證。向試管中加入微量鋅粉，將殘存的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，出現紅色表明有硝酸鹽存在；如沒有顏色變化，則說明沒有硝酸鹽存在，硝酸鹽已被微生物還原成亞硝酸鹽。發酵管中有氣體產生表明有氮氣生成。
(七)明膠液化試驗
有些細菌具有明膠酶(亦稱類蛋白水解酶),能將明膠先水解為多肽，又進一步水解為氨基酸，失去凝膠性質而液化。
1.營養明膠培養基
在營養肉湯中加入10%~15%的明膠，調節pH至7.2，115℃高壓滅菌20min。
試驗方法：挑取18h-24h待試菌培養物，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點種于平板培養基。于20℃-22℃培養7d~14d,明膠高層亦可培養于36℃±1℃。每天觀察結果，若因培養溫度高而使明膠本身液化時應不加搖動、靜置冰箱中待其凝固后，再觀察其是否被細菌液化，如確被液化，即為試驗陽性。平板試驗結果的觀察為在培養基平板點種的菌落上滴加試劑，若為陽性，10min -20min后，菌落周圍應出現清晰帶環，否則為陰性。
2. Frazier明膠瓊脂(改良型)培養基
在營養瓊脂中加入0.4%明膠，調節pH至7.2, 115℃高壓滅菌20 min。
試驗方法：在已倒好干燥培養基的平皿上劃線接種或點接種。在最佳生長溫度下培養2d-14d。使用8mL~10mL1%鹽酸(HCI不像氯化汞溶液那樣能很快的產生清晰的沉淀，但本書仍建議使用鹽酸，這是為了避免汞鹽的毒性及對環境造成的危害)試劑充滿培養皿，沒有水解的明膠與試劑慢慢形成不透明的白色沉淀，水解的明膠部分呈現了一個清晰的環帶。以毫米為單位記錄從菌落邊緣到環帶邊緣的清晰帶的大小。
(八)尿素酶試驗
有些細菌能產生尿素酶，將尿素分解，產生2個分子的氨，使培養基變為堿性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導酶，因為不論底物尿素是否存在，細菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.00。
試驗方法：挑取18h-24h待試菌培養物大量接種于液體培養基管中，搖勻，于36℃±1℃培養10min、60min和120min,分別觀察結果；或涂布并穿刺接種于瓊脂斜面，不要到到達底部，留底部作變色對照。培養2h、4h和24h分別觀察結果，變為粉紅色為陽性，如陰性應繼續培養至4d,做最終判定。
(九)氧化酶試驗
氧化酶亦即細胞色素氧化酶，為細胞色素呼吸酶系統的終末呼吸酶，氧化酶先使細胞色素C氧化，然后此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，產生顏色反應。這個試驗最適用于假單胞菌屬和其他革蘭氏陰性桿菌的鑒別。
試驗方法：在瓊脂斜面培養物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1滴~2滴，陽性者Ko-vacs氏試劑呈粉紅色-深紫色， Ewing氏改進試劑呈藍色。陰性者無顏色改變。應在數分鐘內為判定試驗結果。
(十)硫化氫試驗
有些細菌可分解培養基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。在腸桿菌科的細菌鑒別中有重要作用。
試驗方法：在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養基中，沿管壁穿刺接種，于36℃±1℃培養24h-28h,培養基呈黑色為陽性。陰性應繼續培養至6d。也可用乙酸鉛紙條法：將待試菌接種于一般營養肉湯，再將乙酸鉛紙條懸掛于培養基上空，以不會被濺濕為適度，用管塞住置36℃±1℃培養為1d-6d,紙條變黑為陽性。
(十一)三糖鐵(TSI )瓊脂試驗
試驗方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養物，穿刺接種并涂布于斜面，置36℃±1℃培養18h-24h,觀察結果。
本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發酵產酸或產酸產氣(變黃),產生硫化氫(變黑)。葡萄糖被分解產酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養基中含氮物質，生成堿性產物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。
注意：TSI瓊脂培養基可以代替Kligler鐵瓊脂檢測硫化氫的產生。但是，檸檬酸桿菌和變形桿菌屬中的一些產硫化氫的菌株，在TSI瓊脂培養基中產生的硫化氫會被蔗糖發酵產物所掩蓋，因此，在做這些菌的產硫化氫試驗時， Kligler鐵瓊脂是更為可靠的試驗培養基。
(十二)硫化氫-靛基質一動力瓊脂試驗
試驗方法：以接種針挑取菌落或純養物穿刺接種約二分之一深度，置36℃±1℃培養18h-24h,觀察結果。培養物呈現黑色為硫化氫陽性，混濁或沿穿刺線向外生長為有動力，然后加Kovacs氏試劑數滴于培養表面，靜置10min,若試劑呈紅色為靛基質陽性。培養基未接種的下部，可作為對照。
本試驗用于腸桿菌科細菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯合使用可顯著提高篩選功效。
(十三)檸檬酸鹽利用試驗
以檸檬酸鈉為唯一碳源、pH 7.0的培養基上，某些細菌能分解檸檬酸鈉產生碳酸鹽，使培養基由中性變為堿性，培養基中指示劑溴麝香草酚藍由淺綠色變為深藍色，此為檸檬酸鹽利用試驗陽性。如不能利用檸檬酸鹽，此試驗為陰性反應。將細菌分別接種于檸檬酸鹽培養基斜面上，于37℃培養1d-4d,每日觀察結果。培養基斜面上有細菌生長，而且培養基變成藍色為陽性；無細菌生長，培養基顏色不變保持綠色為陰性。
(十四)鄰硝基苯-8-D吡喃半乳糖苷酶測定
乳糖發酵過程中需要乳糖通透酶和B-半乳糖苷酶才能快速分解。有些細菌只有半乳糖苷酶，因而只能遲緩發酵乳糖，所有乳糖快速發酵和遲緩發酵的細菌均可快速水解鄰硝基酚-B-D-半乳糖苷(0-nitophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG)而生成黃色的鄰硝基酚。用于檸檬酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別。
將0.6g ONPG溶解于100mL,磷酸緩沖液內，過濾滅菌后，與300 ml.蛋白胨水混合，無菌分裝小試管，于冰箱內保存，備用， 1年內使用有效。挑取幼齡斜面培養物一環于上述培養基內，適溫培養24 h;制備濃的菌懸液(于0.5 mL生理鹽水的細管)中加ONPG紙片，35℃-37℃培養24h后，觀察結果。黃色為陽性，無色為陰性。也可直接將培養物接種ONPG試劑， 35℃-37 ℃培養1h-3h即可以觀察結果，如為陰性繼續培養至24h,培養基變黃則為陽性。
(十五)膽汁-七葉苷水解試驗
在10% ~40%膽汁存在下，測定細菌水解七葉苷的能力。七葉苷被細菌分解生成七葉素，七葉素與培養基中的檸檬酸鐵的二價鐵離子發生反應形成黑色化合物。主要用于鑒況D群鏈球菌與其他鏈球菌的區別，以及腸桿菌科的某些種、某些厭氧菌(如：脆弱擬桿菌等)的初步鑒別。D群鏈球菌本試驗為陽性。
將被檢菌接種于膽汁-七葉苷培養基中， 35℃孵育18h~24h后，觀察結果。培養基完全變黑為陽性，不變黑為陰性。
(十六)苯丙氨酸脫氨酶試驗
苯丙氨酸脫氨酶試驗可用于鑒別腸道細菌，例如對大腸桿菌與變形桿菌的鑒別。變形桿菌具有苯丙氨酸脫氨酶，能將苯丙氨酸氧化脫氨，產生苯丙酮酸；而大腸桿菌不具有苯丙酸脫氨酶，不能將苯丙氨酸氧化脫氨，故不能產生苯丙酮酸。
具體操作為：將大腸桿菌和普通變形桿菌分別接種到苯丙氨酸斜面培養基上(注意接種量要大),置于37℃恒溫箱中，培養4h(或18h-24h)。觀察結果時，在培養好的菌種斜面上滴加2滴-3滴10%一氯化鐵溶液，試液自培養物上方流到下方，苯丙酮酸遇三氯化鐵形成綠色化合物，此為陽性反應；若培養基不出現顏色變化，則為陰性反應。
(十七)色氧酸脫氨酶試驗
此法可同時測定色氨酸脫羧酶、脲酶和吲哚3個項目。
1.方法一
(1)培養基
L-色氫酸 3g； NaCl 5g；
KH2PO4 1g; 乙醇(95% ) 10 mL:
K2 HPO4 1g; 蒸餾水 900 mL
加酚紅(25mg~30mg)至微橙的黃色， pH約為6.8~6.9,分裝于三角瓶中， 121℃蒸氣滅菌20min。另將20g尿素溶于100mL水中，過濾滅菌，用無菌操作與上述熱滅菌的培養基相混，并分裝于無菌試管內，每管液層高約3cm ~4cm。
(2)接種與測定：將試驗菌株的幼齡培養物接種于上述培養液中，適溫培養24h,取2滴~4滴培養液，與1滴三氯化鐵溶液(約33%)相混。如呈紅褐色，則為色氨酸脫氨酶陽性反應。如無顏色變化則為陰性反應。可用變形菌作為陽性對照。
(3)結果觀察：如培養后的培養液由黃色轉紅色，表示有脲酶存在。如用對甲基氨基苯甲醛試劑測定，可檢查有無吲哚形成。如不擬測定脲酶，配制培養基時可不加酚紅和尿素。
2.方法二
(1)試液
L-色氨酸 0.2% -0.5%
FeCl3 33%
生理鹽水或pH6. 8緩沖液
A液： KH2PO4, 0.2 mol/L (27. 2 g/L) 50 mL
B液： Na2CO3, 0. 2 mol/L (8.0 g/L) 23. 6 mL
注： A液與B液相混即為pH6.8的緩沖液。
(2)接種與培養：將試驗菌接種于肉汁胨斜面，適溫培養24h。
(3)測定方法：取干凈的試管2支，每管中加4滴L-色氨酸溶液和4滴生理鹽水(或4滴pH6.8緩沖液),然后將測定菌的菌苔混到上述溶液的2支試管中制成濃溶液。另2支試管中不加菌苔作為對照。置室溫15min ~20min后，每管中加入1滴三氯化鐵(33%)溶液，立即呈現紅褐色，表示陽性反應，不變色者表示陰性反應。可用變形菌作為陽性對照。
（十八)氰化鉀試驗
原理：氰化鉀可以抑制某些細菌的呼吸酶系統。細胞色素、細胞色素氧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶均以鐵卟啉作為輔基，氰化鉀能和鐵卟淋結合，使這些酶失去活性，使細菌生長受到抑制。
培養基：
蛋白胨 10.0g;
KH2 PO4 0. 225 g
Na2HPO4 5.64 g
蒸餾水 1000 mL
NaCl 5.0g。
此為基礎液。調節pH至7.6, 121℃滅菌15min,冷卻，置冰箱。
于冷基礎液中加以15 mL0.5%氰化鉀溶液(0.5g氰化鉀溶于100 ml，冷卻的滅菌蒸餾水中),分裝于滅菌小試管，每管約1ml,立即用隨有熱石蠟的軟木寒塞緊，可于冰箱中保存2周。
方法：將20h-24h肉湯培養物，接種。大環到氰化鉀培養基中，立即用軟木塞塞緊，置37℃培養，連續觀察2d,有細菌生長時為陽性反應。大多數沙門氏菌在此培養基中不能生長，即無渾濁現象。
注意：氰化鉀為劇毒藥，宜在通氣櫥內操作。由于氰化鉀有劇毒，接觸皮膚的傷口或吸入微量粉末即可中毒死亡。與酸接觸分解能放出劇毒的氰化氫氣體，與氯酸鹽或亞硝酸鈉混合能發生爆炸。如果必須要進行氰化鉀試驗，使用的都為氰化鉀的替代品。
(十九)鳥氨酸、賴氨酸和精氨酸脫羧酶試驗
1.培養基
渙甲酚紫(1.6% ) 0.625 mL
甲酚紅(0.2% ) 2.5ml
蛋白胨 5g
瓊脂(半固體) 3g~6g
D-葡萄糖 0.5 g
牛肉膏 5g
蒸餾水 1000 mL
維生素B6 (吡哆醛Pyridoxal) 5 mg;
將以上成分加熱溶解，調pH為6,再加指示劑。將上列基礎培養基分為四等份，其中三份分別加入： L-鳥氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸的鹽酸鹽，使濃度達到1%。如用DL型氨基酸，則濃度達到2%。再調pH到6.0~6.3,未加氨基酸的一份基礎培養基作為空白對照。分裝小試管，每管3 mL ~4 ml，121℃滅菌10min，鳥氨酸的培養基中可能有少量絮狀沉淀，但無礙作用。
2.接種
用幼齡培養物作為種菌直接接種，接種后封油。對照管與測定管同時接種。
3.結果觀察
對腸桿菌科的細菌，一般于37℃培養4d,每天觀察。但對非臨床來源的菌可于30℃培養，連續觀察7d.指示劑呈紫色或帶紅色調的紫色者為陽性，呈黃色者為陰性。一般腸桿菌科的細菌于1d-2d呈陽性反應，但也有遲緩陽性者，培養3d-4d才出現陽性反應，對照管應呈黃色。
(二十)精氨酸雙水解酶試驗
1.培養基(索恩利Thornley)
K2HPO4 0.3g;
L-精氧酸鹽 10g
蛋白胨 1g
瓊脂 6g
NaCl 5g
蒸餾水 1000 mL;
酚紅 0.01 g;
L-精氧酸鹽 10g
pH7.0-7.2,分裝試管，培養基高度約4cm ~5 cm, 121℃滅菌15 min。
2.接種與培養
用幼齡種菌穿刺接種，并用滅菌凡士林油封管，適溫培養3d, 7d, 14d觀察。
3.結果觀察
培養基轉為紅色者為陽性，應有不含精氨酸空白對照。
(二十一)過氧化氫酶試驗
過氧化氫酶試驗又名接觸酶試驗，所用試劑為3%過氧化氫溶液(現配現用)。
實驗方法：挑取固體培養基上菌落一接種環，置于潔凈試管內，滴加3%過氧化氫溶液2mL,觀察結果。結果觀察：于0.5min內發生氣泡者為陽性，不發生氣泡者為陰性。
(二十二)血漿凝固酶試驗
血漿凝固酶常用于金黃色葡萄球菌的檢測，當發現可疑菌落時，挑取平板上的可疑菌落1個或以上，分別接種到5ml腦心浸液肉湯(BHI)和營養瓊脂小斜面， 36℃±1℃培養8h-24h。
取新鮮配置的免血漿(現在有很多廠商生產的方便使用的凍干兔血漿) 0.5mL,放入小試管中，再加入BHI培養物0.2ml~0.3mL,振蕩搖勻，置36℃±1℃溫箱或水浴箱內，每0.5h觀察一次，觀察6h,如呈現凝固(即將試管傾斜或倒置時，呈現凝塊)或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結果。同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養物作為對照。使用商品化的試劑時，按說明書進行操作。
結果如果可疑，挑取營養瓊脂小斜面的菌落到5mL, BHI, 36℃ ±1℃培養18h-48h,重復試驗。
