​1 目的

1.1學(xué)習(xí)掌握微生物的幾種接種技術(shù)

1.2 建立無菌操作的概念，掌握無菌操作的基本環(huán)節(jié)

2 實驗說明

將微生物的培養(yǎng)物或含有微生物的樣品移植到培養(yǎng)基上的操作技術(shù)稱之為接種。接種是微生物實驗及科學(xué)研究中的一項最基本的操作技術(shù)。無論微生物的分離、培養(yǎng)、純化或鑒定以及有關(guān)微生物的形態(tài)觀察及生理研究都必須進(jìn)行接種。接種的關(guān)鍵是要嚴(yán)格的進(jìn)行無菌操作，如操作不慎引起污染，則實驗結(jié)果就不可靠，影響下一步工作的進(jìn)行。

3 實驗器材

3.1 器械和用品

酒精燈，玻璃鉛筆，火柴，試管架、接種環(huán)、接種針、接種鉤、滴管、移液管、三角型接種棒等接種工具。

3.2 菌種和培養(yǎng)基

菌種：大腸桿菌（Escherichia coli），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。 培養(yǎng)基：普通瓊脂斜面和平板,營養(yǎng)肉湯,普通瓊脂高層(直立柱)。

4 實驗流程

斜面接種法→液體接種法→固體接種法→穿刺接種法。

5 操作步驟

5.1 斜面接種法

斜面接種法主要用于接種純菌，使其增殖后用以鑒定或保存菌種。

通常先從平板培養(yǎng)基上挑取分離的單個菌落，或挑取斜面，肉湯中的純培養(yǎng)物接種到斜面培養(yǎng)基上。操作應(yīng)在無菌室、接種柜或超凈工作臺上進(jìn)行，先點燃酒精燈。

將菌種斜面培養(yǎng)基(簡稱菌種管)與待接種的新鮮斜面培養(yǎng)基(簡稱接種管)持在左手拇指、食指、中指及無名指之間，菌種管在前，接種管在后，斜面向上管口對齊，應(yīng)斜持試管呈45～0度角，并能清楚地看到兩個試管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸濕培養(yǎng)基表面。以右手在火焰旁轉(zhuǎn)動兩管棉塞，使其松動，以便接種時易于取出。

右手持接種環(huán)柄，將接種環(huán)垂直放在火焰上灼燒。鎳鉻絲部分（環(huán)和絲）必須燒紅，以達(dá)到滅菌目的，然后將除手柄部分的金屬桿全用火焰灼燒一遍，尤其是接鎳鉻絲的螺口部分，要徹底灼燒以免滅菌不徹底。用右手的小指和手掌之間及無名指和小指之間撥出試管棉塞，將試管口在火焰上通過，以殺滅可能沾污的微生物。棉塞應(yīng)始終夾在手中如掉落應(yīng)更換無菌棉塞。

將灼燒滅菌的接種環(huán)插入菌種管內(nèi)，先接觸無菌苔生長的培養(yǎng)基上，待冷卻后再從斜面上刮取少許菌苔取出，接種環(huán)不能通過火焰，應(yīng)在火焰旁迅速插入接種管。在試管中由下往上做S形劃線。接種完畢，接種環(huán)應(yīng)通過火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔細(xì)灼燒接種環(huán)后，放回原處，并塞緊棉塞。將接種管貼好標(biāo)簽或用玻璃鉛筆劃好標(biāo)記后再放入試管架，即可進(jìn)行培養(yǎng)。

5．2 液體接種法

多用于增菌液進(jìn)行增菌培養(yǎng)，也可用純培養(yǎng)菌接種液體培養(yǎng)基進(jìn)行生化試驗，其操作方法與注意事項與斜面接種法基本相同，僅將不同點介紹如下：

由斜面培養(yǎng)物接種至液體培養(yǎng)基：用接種環(huán)從斜面上沾取少許菌苔，接至液體培養(yǎng)基時應(yīng)在管內(nèi)靠近液面試管壁上將菌苔輕輕研磨并輕輕振蕩，或?qū)⒔臃N環(huán)在液體內(nèi)振搖幾次即可。如接種霉菌菌種時，若用接種環(huán)不易挑起培養(yǎng)物時，可用接種鉤或接種鏟進(jìn)行。

由液體培養(yǎng)物接種液體培養(yǎng)基時，可用接種環(huán)或接種針沾取少許液體移至新液體培養(yǎng)基即可。也可根據(jù)需要用吸管、滴管或注射器吸取培養(yǎng)液移至新液體培養(yǎng)基即可（圖 4-5）。

接種液體培養(yǎng)物時應(yīng)特別注意勿使菌液濺在工作臺上或其他器皿上，以免造成污染。如有濺污，可用酒精棉球灼燒滅菌后，再用消毒液擦凈。凡吸過菌液的吸管或滴管，應(yīng)立即放入盛有消毒液的容器內(nèi)。

5.3 固體接種法

普通斜面和平板接種均屬于固體接種，斜面接種法已講了，不再贅述。固體接種的另一種形式是接種固體曲料，進(jìn)行固體發(fā)酵。按所用菌種或種子菌來源不同可分為：

用菌液接種固體料，包括用菌苔刮洗制成的菌懸液和直接培養(yǎng)的種子發(fā)酵液。接種時按無菌操作將菌液直接倒入固體料中，攪拌均勻。但要注意接種所用水容量要計算在固體料總加水量之內(nèi)，否則會使接種后含水量加大，影響培養(yǎng)效果。

用固體種子接種固體料。包括用孢子粉、菌絲孢子混合種子菌或其他固體培養(yǎng)的種子菌。將種子菌于無菌條件下直接倒入無菌的固體料中即可，但必須充分?jǐn)嚢枋怪�混合均勻。一般是先把種子菌和少部分固體料混勻后再拌大堆料。

5.4 穿刺接種法

此法多用于半固體、醋酸鉛、三糖鐵瓊脂與明膠培養(yǎng)基的接種，操作方法與注意事項與斜面接種法基本相同。但必須使用筆直的接種針，而不能使用接種環(huán)。

接種柱狀高層或半高層斜面培養(yǎng)管時，應(yīng)向培養(yǎng)基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿原路抽出接種針。注意勿使接種針在培養(yǎng)基內(nèi)左右移動，以使穿刺線整齊，便于觀察生長結(jié)果。

6 結(jié)果

分別記錄并描繪平板劃線、斜面和半固體接種的微生物生長情況和培養(yǎng)特征。

7 思考

7.1 如何確定平板上某單個菌落是否為純培養(yǎng)？請寫出實驗的主要步驟。

7.2 為什么高氏I號培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基中要分別加入酚和鏈霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離一種對青霉素具有抗性的細(xì)菌，你認(rèn)為應(yīng)如何做？

7.3 試述如何在接種中，貫徹?zé)o菌操作的原則?