動(dòng)物細(xì)胞融合
細(xì)胞融合是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并成為一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。在自然情況下,體內(nèi)和體外培養(yǎng)的細(xì)胞均能發(fā)生自發(fā)融合現(xiàn)象。人工方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合開(kāi)始于50 年,現(xiàn)在這項(xiàng)技術(shù)已成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫,腫瘤及細(xì)胞工程的重要手段。在誘導(dǎo)物(如仙臺(tái)病毒,聚乙二醇)作用下,相互融合的細(xì)胞發(fā)生凝集,隨后在質(zhì)膜接觸處發(fā)生質(zhì)膜成份的一系列變化,主要是某些化學(xué)鍵的斷裂與重排,最后打通兩質(zhì)膜,形成雙核或多核細(xì)胞(此時(shí)稱(chēng)同核體或異核體)。通過(guò)有絲分裂,細(xì)胞核便發(fā)生融合,形成雜種細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法
1. 用注射器取2ml Alsver 液,再?gòu)囊硐蚂o脈取雞血2ml,注入試管內(nèi),再加6ml Alsver 液,混勻后置4℃冰箱中可備作3—4 天用。
2. 實(shí)驗(yàn)時(shí)取“1”液1ml 于離心管中,加入4ml 0.85%的NaCl 液,混勻平衡后以1200r/min離心5 分鐘。
3. 去上清液。再重復(fù)“2”兩次,最后一次離心10 分鐘。
4. 在沉降血球中加入1mlGKN 液,混勻使之成為細(xì)胞懸液。(可加GKN 液調(diào)節(jié)稀釋使每立方毫米含紅細(xì)胞3~4 萬(wàn)個(gè))。
5. 在“4”液中加入6—8 滴(約0.5ml)50%的PEG 液,迅速混勻,常溫下2~3min 滴片鏡檢。觀察時(shí)注意不同程度的融合現(xiàn)象。通常分為五個(gè)階段。①兩細(xì)胞膜接觸,粘連;②細(xì)胞膜形成穿孔;③兩細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)連通;④通道擴(kuò)大,兩細(xì)胞連成一體;⑤細(xì)胞完全合并,形成一個(gè)含有兩個(gè)或多個(gè)核的圓形細(xì)胞。
6. 計(jì)算融合率。
實(shí)驗(yàn)用品
1. 器具 顯微鏡 離心機(jī) 天平 離心管 注射器 細(xì)滴管 載片、蓋片
2. 試劑 50%聚乙二醇(PEG):稱(chēng)取一定量的PEG(MW=4000)放入刻度試管,在酒精燈火或沸水中加熱溶化。待冷至50℃時(shí),加入等體積并預(yù)熱至50℃的GKN 液混勻。
Alsver 液:葡萄糖2.05g 檸檬酸鈉0.8g NaCl 0.42g,加重蒸水至100ml。
GKN 液:NaCl 8g,KCl 0.4g,Na2HPO4·2H2O 1.77g,NaH2PO·2H2O 0.69g,葡萄糖2g,酚紅0.01g,溶于1000ml 重蒸水中。
0.85%NaCl 液
3. 材料 一齡公雞靜脈血