實驗一 常用培養基的制備、滅菌與消毒

一、實驗目的

    1、掌握配制培養基的一般方法和步驟;掌握干熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過濾除菌的操作方法;

    2、了解培養基的配制原理;了解常見滅菌、清毒基本原理及方法.

二、實驗原理

    培養基是人工按一定比例配制的供微生物生長繁殖和合成代謝產物所需要的營養物質的混合物.培養基的原材料可分為碳源、氮源、無機鹽、生長因素和水.根據微生物的種類和實驗目的不同,培養基也有不同的種類和配制方法.

牛肉膏蛋白胨培養基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養基,有時又稱為普通培養基.由于這種培養基中含有一般細胞生長繁殖所需要的最基本的營養物質,所以可供微生物生長繁殖之用.

干熱天菌、高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質變性從而達到殺死微生物的效果.

三、試劑與器材

    1、器材 試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養基、分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、吸管、培養皿、電烘箱、注射器、微孔濾膜過濾器、鑷子等.

    2、試劑 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂

四、實驗內容

    1、稱量→溶化→調pH→過濾→分裝→加塞→包扎→滅菌→無菌檢查

    2、干熱滅菌:裝入待滅菌物品→升溫→恒溫搖床→降溫→開箱取物

    3、高壓蒸汽滅菌:加水→裝物品→加蓋→加熱→排冷空氣→加壓→恒壓→降壓回零→排汽→取物→無菌檢查

    4、過濾除菌:組裝滅菌→連接→壓濾→無菌檢查→清洗滅菌

五、關鍵步驟及注意事項

    1、要嚴格按配方配制.

    2、調pH不要過頭.

    3、干熱滅菌要注意物品不要堆放過緊,注意溫度的時間控制,70oC以下放物、取物.

    4、高壓滅菌要注意物品不要過多,加熱后排除冷空氣,到時降壓回零取物.

    5、過濾除菌要注意各部件滅菌,壓濾時,壓力要適當,不可太猛太快,濾膜要注意清洗保存.

六、思考題

    1、培養基配好后,為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養基是無菌的？

    2、在配制培養基的操作過程中應注意些什么問題?為什么？

    3、培養微生物的培養基應具備哪些條件?為什么？

    4、培養基的配制原則是什么？

實驗二 土壤中微生物分離純化培養

一、實驗目的

    1、掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術;掌握微生物培養方法;

    2、了解不同的微生物菌落在斜面上、半固體培養基和液體培養基中的生長特征;進一步熟練和掌握微生物無菌操作技術.

二、實驗原理

    從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化.

常用的分離、純化方法:單細胞挑取法,稀釋涂布平板法,稀釋混合平板法,平板劃線法.

稀釋涂布平板法步驟:倒平板－制備土壤污水稀釋液－涂布－培養－挑菌落.

平板劃線法步驟:倒平板－標記培養基名稱－劃線.

三、試劑與器材

    1、器材 盛9ml無菌水的試管、盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶、無菌玻璃涂棒、無菌吸管、接種環、酒精燈、無菌培養皿、顯微鏡、血細胞計數板等.

    2、試劑 牛肉膏蛋白胨培養基,高氏1號培養基,查氏培養基

四、實驗內容

    1、土壤稀釋液的制備

    2、微生物分離純化:稀釋涂平板法,平皿劃線分離法,微生物培養技術

五、關鍵步驟及注意事項

    1、掌握含菌培養基的配制,嚴格控制溫度.

    2、平板劃線應防止染菌,同時應注意劃線深度及密度.

六、思考題

    1、如何確定平板上某單個菌落是否為純培養？請寫出實驗的主要步驟.

    2、如果要分離得到極端嗜鹽細菌,在什么地方取樣品為宜？并說明理由. 

實驗三 菌種保藏

一、實驗目的

    1、學習并掌握菌種保藏的基本原理.

    2、掌握常用的幾種不同的菌種保藏方法.

二、實驗原理

    微生物個體微小、代謝旺盛、生長繁殖快,如果保存不妥容易發生變異和雜菌污染,甚至導致細胞死亡等現象.因此,保存好菌種是非常必要和重要的.常用的菌種保藏方法包括傳代培養法、載體法、懸液法、冷凍法和真空干燥法

三、試劑與器材

    1、材料 大腸桿菌、青霉菌、放線菌

    2、試劑 液體石蠟、甘油、五氧化二磷、95％乙醇、10％鹽酸、無水氯化鈣、食鹽、干冰

    3、器材 無菌吸管、無菌滴管、無菌培養皿;安額管、凍干管、40目與100目篩子、油紙、濾紙條(0.5X1、2cm)、干燥器、真泵器、真空泵、真空壓力表、噴燈、L形五通管、冰箱、低溫冰箱(—30℃)、超低溫冰箱和液氮罐等.

四、實驗內容

    1、斜面保藏法

    2、液體石蠟法

    3、穿刺保藏法

    4、砂土管保藏法

    5、冷凍真空干燥保存法

五、關鍵步驟及注意事項

    1、清楚各種保藏方法的優缺點,針對不同要求選擇適宜的保藏方法.

    2、熔封安瓶時防止封閉不嚴.

    3、液氮凍存操作應防止凍傷.

六、思考題

    根據你自己的實驗談談1--2種菌種保藏方法的利弊? 

實驗四 細菌形態觀察及單染色

一、實驗目的

    1、了解簡單染色法的原理,并掌握其操作方法.

    2、學習并掌握微生物涂片、染色的基本技術和無菌操作技術.

    3、鞏固顯微鏡(油鏡)的使用方法.

    4、初步認識細菌的形態特征.

二、實驗原理

    細菌個體微小,且較透明,必須借助染色法使菌體著色,與背景形成鮮明的對比,以便在顯微鏡下進行觀察.根據實驗目的不同,可分為簡單染色法、鑒別染色法和特殊染色法等.簡單染色法是最基本的染色方法,是利用單一染料對細菌進行染色.此法操作簡便,適用于菌體一般形狀和細菌排列的觀察.常用堿性染料進行簡單染色.

三、試劑與器材

    1、材料 大腸桿菌,枯草芽孢桿菌

    2、試劑 呂氏堿性美藍染液(或草酸銨結晶紫染液)、齊氏石炭酸復紅染液.

    3、器材 顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環、雙層瓶(內裝香柏油和二甲苯)等.

四、實驗內容

    簡單染色法:涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢

五、關鍵步驟及注意事項

    1、涂片時,生理鹽水及取菌不宜過多,涂片應盡可能均勻,

    2、水洗步驟水流不宜過大,過急,以免涂片薄膜脫落.

六、思考題

    1、你認為制備細菌染色標本時,尤其應該注意哪些環幣?

    2、為什么要求制片完全干燥后才能用油鏡觀察?

    3、如果你的涂片未經熱固定,將會出現什么問題?如果加熱溫度過高、實驗五 放線菌及霉菌形態觀察

一、實驗目的 　　

1、了解放線菌、霉菌形態觀察的原理; 　　

2、學習并掌握觀察放線菌、霉菌形態的操作方法; 　　

3、初步了解放線菌、霉菌的形態特征.

二、實驗原理 　　

    放線菌是指能形成分枝絲狀體或菌絲體的一類革蘭氏陽性細菌.常見放線菌大多能形成菌絲體,緊貼培養基表面或深入培養基內生長的叫基內菌絲(簡稱“基絲”),基絲生長到一定階段還能向空氣中生長出氣生菌絲(簡稱“氣絲”),并進一步分化產生孢子絲及孢子.有的放線菌只產生基絲而無氣絲.在顯微鏡下直接觀察時,氣絲在上層、基絲在下層,氣絲色暗,基絲較透明.孢子絲依種類的不同,有直、波曲、各種螺旋形或輪生. 　　

    霉菌可產生復合分枝的菌絲體,分基內菌絲和氣生菌絲,氣生菌絲生長到一定階段分化產生繁殖菌絲,由繁殖菌絲產生孢子.霉菌菌絲體(尤其是繁殖菌絲) 及孢子的形態特征是識別不同種類霉菌的重要依據.霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細菌和放線菌粗得多,常是細菌菌體寬度的幾倍至幾十倍,因此,用低倍顯微鏡即可觀察.人們設計了各種培養和觀察方法,這些方法的主要目的是為了盡可能保持放線菌自然生長狀態下的形態特征.本實驗采用插片法. 　　

    插片法:將放線菌接種在瓊脂平板上,插上滅菌蓋玻片后培養,使放線菌菌絲沿著培養基表面與蓋玻片的交接處生長而附著在蓋玻上.觀察時,輕輕取出蓋玻片,置于載玻片上直接鏡檢.這種方法可觀察到放線菌自然生長狀態下的特征,而且便于觀察不同生長期的形態.

三、試劑與器材 　　

    1、材料 黑曲霉、青霉和根霉,細黃鏈霉菌或青色鏈霉菌,滅菌的高氏I號瓊脂和滅菌的查氏培養基. 　　

    2、實驗器材 經滅菌的:平皿、玻璃紙、無菌吸管、蓋玻片、玻璃涂棒,以及載玻片、接種環、接種鏟、鑷子、顯微鏡等.

四、實驗內容 　　

    倒平板→接種→插片→培養→鏡檢

五、關鍵步驟及注意事項 　　

    1、倒平板要厚一些,接種時劃線要密. 　　

    2、插片時要有一定角度并與劃線垂直. 　　

    3、觀察時,宜用略暗光線;先用低倍鏡找到適當視野,更換高倍鏡觀察. 　　

    4、如果用0、1%美藍對培養后的蓋玻片進行染色后觀察,效果會更好.

六、思考題 　　

    1、鏡檢時,你如何區分放線菌的基內菌絲和氣生菌絲？　　

    2、你認為霉菌和放線菌菌絲的主要區別是什么？

實驗六 革蘭氏染色及芽孢染色

一、實驗目的

    1、了解革蘭氏染色法和芽孢染色法的原理,并掌握其操作方法;

    2、了解革蘭氏染色法在細菌分類鑒定中的重要性;

    3、學習并掌握微生物涂片、染色的基本技術和無菌操作技術;

    4、學習顯微鏡(油鏡)的使用方法;

    5、初步認識細菌的形態特征.

二、實驗原理

    革蘭氏染色法的基本步驟是:先用初染劑結晶紫進行染色,再用碘液媒染,然后用乙醇(或丙酮)脫色,最后用復染劑(如番紅)復染.經此方法染色后,細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌;如果細胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細菌染上復染劑的顏色(紅色),該菌屬于革蘭氏陰性菌.革蘭氏染色反應是細菌重要的鑒別特征,為保證染色結果的正確性,采用規范的染色方法是十分必要的.芽孢染色法的基本原理,用著色力強的染色劑孔雀綠或石炭酸復紅,在加熱條件下染色,使染料不僅進入菌體也可進入芽孢內,進入菌體的染料經水洗后被脫色,而芽孢一經著色難以被水洗脫,當用對比度大的復染劑染色后,芽孢仍保留初染劑的顏色,而菌體和芽孢囊被染成復染劑的顏色,使芽孢和菌體更易于區分.

三、試劑與器材

    1、材料:枯草芽孢桿菌12～18h營養瓊脂斜面培養物,大腸桿菌約24h營養瓊脂斜面培養物

    2、試劑 革蘭氏染色液(結晶紫液、碘液、95％乙醇、番紅液).5％孔雀綠水溶液

    3、實驗器材 小試管、滴管、燒杯、試管架、濾紙、木夾子、載玻片、蓋玻片、凹載玻片、無菌水、顯微鏡等、接種環、雙層瓶(內裝香柏油和二甲苯)、擦鏡紙、生理鹽水等.

四、實驗內容

    1、革蘭氏染色法 制片→初染→媒染→脫色→復染→鏡檢.

    2、Schaefer-Fulton氏染色法 制片→染色→水洗→復染→水洗→鏡檢.

五、關鍵步驟及注意事項

    1、涂片時,生理鹽水及取菌不宜過多,涂片應盡可能均勻,

    2、乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關鍵環節,嚴格掌握脫色時間.

六、思考題

    1、你認為要得到正確的改良的革蘭氏染色結果必須注意哪些操作？關鍵在哪一步？為什么？

    2、現有一株細菌寬度明顯大于大腸桿菌的粗壯桿菌,請你鑒定其革蘭氏染色反應.你怎樣運用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為對照菌株進行涂片染色,以證明你的染色結果正確性.

    3、你的染色結果是否正確？如果不正確,請說明原因.

    4、若涂片中觀察到的只是大量游離芽孢,很少看到芽孢囊及營養細胞,你認為這是什么原因？

    5、說明芽孢染色法的原理.用簡單染色法能否觀察到細菌的芽孢？

實驗七 酵母菌的形態觀察及死活細胞的鑒定

一、實驗目的

    1、觀察酵母菌的形態特征、出芽生殖方式,并掌握酵母菌與細菌形態特征的區別.

    2、學習鑒別死活細胞的實驗方法.

二、實驗原理

    酵母菌是單細胞的真核微生物,菌體比細菌大而且不運動.酵母菌的繁殖方式分為無性繁殖和有性繁殖兩種,以無性繁殖為主.芽殖是酵母菌普遍的無性繁殖方式,少數為裂殖;有性繁殖是產生子囊和子囊孢子.本實驗是通過美藍染液水浸片和水一碘液水浸片來觀察酵母的形態和芽殖方式.

美藍是一種無毒性的染料,它的氧化型呈藍色,還原型無色.用美藍對酵母活細胞染色時,由于細胞的新陳代謝作用,細胞內具有較強的還原能力,能使美藍由藍色的氧化型變為無色的還原型,而對代謝作用微弱或死細胞,無此還原能力或還原能力極弱,而被美藍染成藍色或淡藍色.因此,不僅用此法可觀察酵母細胞形態,也可用來鑒別酵母菌的死細胞和活細胞.

三、試劑與器材

    1、材料 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡爾酵母(Saccharomyces calsbergensis)培養2天左右的麥芽汁(或豆芽汁)液體培養物.

    2、試劑 0.05％和O.1％呂氏堿性美藍染色液、革蘭氏染色用的碘液.

    3、器材 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環、灑精燈等.

四、實驗內容

    1、美藍浸片觀察 酵母培養→制片→染色→鏡檢→30分鐘后再鏡檢

    2、水-碘浸片觀察

五、關鍵步驟及注意事項

    1、染液不宜過多或過少,否則,在蓋上蓋玻片時,菌液溢出或出現大量氣泡.

    2、用鑷子取一塊蓋玻片,先將一側與菌液接觸,然后慢慢將蓋玻片放下,使其蓋在菌液上,蓋玻片不宜平著放下,避免氣泡產生.

六、思考題

    1、呂氏堿性美藍染液濃度和作用時間的不同,對酵母菌死細胞數量有何影響？試分析其原因.

    2、在顯微鏡下,酵母菌有哪些突出的特征區別于一般細菌？ 

實驗八 微生物直接計數法及測微技術

一、實驗目的

    1、了解血球計數板計數原理,并掌握計數方法.

    2、掌握用測微尺測定微生物大小的方法.

二、實驗原理

    顯微鏡直接計數法是將一定稀釋的菌體或孢子懸液注入血球計數板的計數室中,于顯微鏡下直接計數的一種簡便、快速、直觀的方法.因為計數板是一塊特別的載玻片.其上由四條槽構成三個平臺;中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半,每一邊的平臺上各刻有一個方格網,每個方格網共分為九個大方格,一種是一個大方格分成25個中方格,而每個中方格又分成16個小方格(見圖2—3—44);另一種是一個大方格分成16個中方格,每個中方格又分成25個小方格,無論哪種每個大方格中的小方格都是400個.每一個大方格邊長為0.1mm,所以計數室的容積為0.1mm³.計數時,通常只用5個中格內的菌體(孢子)數即可.然后求出每個中方格的平均值,再乘上25或16,得出一個大方格中的總茵數,再換算成lml菌液中的總菌數.若設5個中方格中總菌數為N,菌液稀釋倍數為M,如果是25個中方格計數板,則計算方法為:

　　　　lml菌液中的總菌數=平均每個中格中菌的個數×25×104×M=50000N•M(個)

微生物細胞的大小是微生物基本的形態特征,也是分類鑒定的依據之一.微生物大小的測定,需要在顯微鏡下,借助于特殊的測量工具——測微尺,包括目鏡測微尺和鏡臺測微尺.鏡臺測微尺是中央部分刻有精確等分線的載玻片,一般是將1mm等分為100格,每格長0.01mm(即10pm).鏡臺測微尺并不直接用來測量細胞的大小,而是用于校正目鏡測微尺每格的相對長度.

三、試劑與器材

    1、材料 釀酒酵母、藤黃微球菌和大腸桿菌的染色標本片、釀酒酵母24h馬鈴薯斜面培養物.

    2、實驗器材 細胞計數板、顯微鏡、蓋玻片、無菌毛細滴管、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、載玻片、蓋玻片、顯微鏡等.

四、實驗內容

    1、微生物直接計數法 菌懸液制備→鏡檢計數室→加樣品→顯微鏡計數→清洗血細胞計數板

    2、微生物測微技術 裝目鏡測微尺→校正→菌體大小測定

五、關鍵步驟及注意事項

    1、防止加樣空氣泡產生.

    2、調節顯微鏡光線的強弱適當.

六、思考題

    1、根據你的體會,說明用血細胞計數板計數的誤差主要來自哪些方面？應如何盡量減少誤差、力求準確？

    2、某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率,請設計1～2種可行的檢測方法.

    3、為什么更換不同放大倍數的目鏡或物鏡時,必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺進行校正？