1. 培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分

    各種微生物對碳源、氮源要求各異,有的對營養(yǎng)還有特殊的要求,事先了解被分離微生物的營養(yǎng)要求,從而設(shè)計一個合理快速的分離培養(yǎng)基,能夠收到事半功倍的效果.

放線菌是生產(chǎn)抗生素和酶制劑的重要來源.在選擇分離放線菌時,通常采用改良的HV瓊脂培養(yǎng)基、土豆-胡蘿卜水汁液培養(yǎng)基和淀粉瓊脂培養(yǎng)基能取得較好的效果.但不同菌種對營養(yǎng)要求差別很大,如奴卡氏菌在有氧條件下用普通培養(yǎng)基即可分離到,而以色列放線菌則在有CO2存在且有適宜培養(yǎng)基的情況下才能正常生長繁殖.

篩選水解酶產(chǎn)生菌時,通常利用以底物為惟一碳、氮源的平板進行分離,如以淀粉為碳源的培養(yǎng)基可鑒定菌落能否產(chǎn)生淀粉酶；一種含纖維素粉為碳源的分離培養(yǎng)基,可以鑒別纖維素酶產(chǎn)生菌；用含有酪蛋白為有機氮源的平板培養(yǎng)基,可以鑒別蛋白酶的產(chǎn)生菌.純種分離時,把以上瓊脂平板置于適宜的溫度培養(yǎng)一定的時間,如具有產(chǎn)生水解酶能力的菌株,便在菌落四周形成水解圈或呈色圈,根據(jù)圈的大小可初步判斷酶活力強弱.測定水解圈直徑與菌落直徑之比,把比例大的菌落移入斜面保藏,供進一步篩選.

 

2. 培養(yǎng)基的pH

    細菌、放線菌的生長繁殖對pH一般要求偏堿,霉菌和酵母菌要求偏酸.因此,分離培養(yǎng)基的pH應(yīng)該調(diào)節(jié)到被分離微生物要求范圍.這不僅有利于自身生長,也可排除一部分不需要的菌類.例如,分離檸檬酸產(chǎn)生菌的黑曲霉,就是利用調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的酸堿度獲得成功的.其分離方法是：取紅芋粉醪20%、檸檬酸 10%～20%配成培養(yǎng)液,調(diào)節(jié)pH2.0～2.5,以一定量的培養(yǎng)基和土樣均勻混合,用毛細吸管點種在平皿內(nèi)事先覆蓋的無菌濾紙上（2～3層）,于 30℃培養(yǎng),這樣可以分離到產(chǎn)生檸檬酸的黑曲霉.

分離堿性蛋白酶和堿性脂肪酶產(chǎn)生菌時,可以把培養(yǎng)基調(diào)到pH9～11,在此范圍內(nèi)不宜生長的微生物被抑制,這對分離本身起到濃縮作用.大多數(shù)水解酶的生長最適pH基本相近,而酶的作用pH未必與產(chǎn)酶pH相同.

    培養(yǎng)基的pH要結(jié)合營養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件來考慮.因為微生物在生長繁殖過程中,由于代謝作用會產(chǎn)生酸性或堿性產(chǎn)物,pH發(fā)生變化,微生物生長受到抑制.一般培養(yǎng)基中碳氮比（C/N）高者,培養(yǎng)后傾向于酸性,反之則傾向于堿性.無機鹽的性質(zhì)也會影響pH變化,（NH4）2SO4是生理酸性無機氮源,其中NH4+被菌體利用,留下SO42-,培養(yǎng)液變成酸性.而NaNO3是生理堿性氮源,其中NO3-被菌體分解利用后,剩余Na+,使培養(yǎng)液變成堿性.如發(fā)酵過程缺氧,則代謝向有機酸合成方向進行,pH下降.為了維持培養(yǎng)基的PH,一般要加磷酸鹽,如K2HPO4、KH2PO4,使培養(yǎng)基具有一定的緩沖能力.如果培養(yǎng)液中的酸堿變化很大,磷酸鹽的緩沖容量不足以調(diào)節(jié)pH變化,則可適當(dāng)加入碳酸鈣,以不斷中和菌體代謝過程中產(chǎn)生的酸類,使培養(yǎng)基的pH能保持在恒定的范圍內(nèi).此外,在分離霉菌時,加幾滴乳酸不僅可以維持一定酸堿度,而且可以抑制細菌的生長.

3. 排除不需要的菌類

    采取調(diào)節(jié)pH的方法來抑制非目的微生物的生長,雖然能起到一定的作用,但并不是對所有的菌類都有效.有些細菌和放線菌同樣可以在酸性環(huán)境下生長,而個別的霉菌,也同樣可以在中性或偏堿的培養(yǎng)基中生長.為了更有效地抑制非目的微生物的生長,要加入一些專一性的抑制劑.

（1）分離細菌時,在培養(yǎng)基中加入濃度為50U/ml制霉菌素,可以抑制霉菌和酵母菌的生長.

（2）分離放線菌時,在樣品中加入0.05%十二烷基磺酸鈉（SDS）不僅可以抑制細菌的生長,還能激活放線菌孢子的萌發(fā).加入氟哌酸（5mg/L）+ 制霉菌素（50mg/L）+ 青霉素（0.8mg/L）也可以有效地抑制細菌和真菌,而不影響放線菌的生長.

（3）分離霉菌和酵母菌時,在培養(yǎng)基中加入青霉素、鏈霉素和四環(huán)素各30U/ml,可以抑制細菌和放線菌生長.

（4）分離根霉和毛霉時,由于這些微生物的菌絲易蔓延成片,難以得到純化的菌落,通常在培養(yǎng)基中添加0.1%去氧膽酸鈉或山梨醇防止菌絲蔓延,使菌落長得小而緊密.

  一般用于分離單一目的微生物的培養(yǎng)基中均含有抑制其他微生物的抑制劑,這些專用的抑制劑在小型實驗室配制較麻煩,現(xiàn)已有成品供應(yīng),只要直接加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基即可.如氨芐西林,主要用于分離親水氣單孢菌.

 

4. 控制培養(yǎng)溫度

    控制培養(yǎng)溫度,也是一種獲得目的微生物的有效措施.各類微生物生長溫度不同,從大范圍來看,可分三大類：一類是高溫微生物,最適溫度在50～60℃.如果要分離這類菌可將分離培養(yǎng)基置于50～60℃溫度下培養(yǎng),能抑制一些嗜冷、中性微生物生長,可以有效地分離到高溫菌類.第二類是中溫微生物,它們的最適生長溫度是20～40℃,超過50℃,就停止生長.這類微生物最為常見,、數(shù)量都占首位.工業(yè)發(fā)酵微生物絕大多數(shù)都屬于此類.其中不同類群微生物對溫度又有所差別,一般細菌、放線菌最適溫度為25～37℃,霉菌和酵母最適溫度為20～28℃.第三類為低溫微生物,它們的最適溫度為15℃或更低.當(dāng)從樣品中分離各種菌類時,分別置于自身最適溫度下培養(yǎng)也可大體上抑制另一些微生物的生長.當(dāng)分離某些特殊產(chǎn)物的微生物時,對溫度的選擇還需考慮某些內(nèi)在的關(guān)系,如在篩選不飽和脂肪酸產(chǎn)生菌時,由于細胞膜中所含的不飽和脂肪酸含量越高,其凝固點越低,即細胞在較低溫度下仍能表現(xiàn)出活力,因此在低于正常溫度10℃下分離效果最好.