王華

中國檢驗認證集團山東有限公司

摘要：在HACCP體系的建立和實施過程中，控制病原微生物一直是各類食品加工的重點�？焖贆z測食品中病原微生物不僅有利于食品安全管理體系及時驗證控制措施實施效果，而且有利于對潛在不安全產(chǎn)品迅速采取糾正和糾正措施。對食源性病原微生物進行準(zhǔn)確、靈敏、省時、省力和省成本的快速檢驗方法已經(jīng)成為保證食品安全的迫切需求。食品檢測中常用的病原微生物快速檢測方法包括分子生物學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、代謝技術(shù)、紙片法、細菌直接計數(shù)法、噬菌體鑒定技術(shù)、全自動微生物分析系統(tǒng)等。本文對上述各種快速檢測食品中微生物的方法的研究進展作一綜述。

關(guān)鍵詞：快速檢測；病原微生物；食品；安全

Abstract: During the establishing and implementation of HACCP and Food Safety Management System, the most important thing is always the controllment of pathogenic microorganism. The quick inspection methods for pathogenic microorganism in food are benefit for not only verifing the control measures in time, but also taking corretion and correction measures to potential unsafety food. It is necessary for food safety to make quick inspection of pathogenic microorganisms, for the virtue of accuation, sensitivity, time-saving, labor-saving and low costaction. The quick inspection methods of pathogenic microorganisms in the food include molecular biology detection method, immunology method, metabolic method, quick inspection paper, bacterium direct counting method, automatic microbial monitoring system etc.  This article has summarized the quick inspection methods of pathogenic microorganisms in the food.

Key words: Quick inspection；Pathogenic Microorganisms；Food；Safety

食品安全問題一直是各國政府和人民群眾最為關(guān)心的問題，由病原微生物引起的食源性疾病是影響食品安全的最主要的因素之一。在HACCP體系的建立和實施過程中，病原微生物一直是各類食品加工行業(yè)控制的重點。目前，傳統(tǒng)的食源性病原菌的檢測、鑒定仍停留在分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生化鑒定和血清學(xué)分型水平。這些方法操作煩瑣、需要時間較長、準(zhǔn)備和收尾工作繁重，檢測周期較長，而且無法對難以培養(yǎng)的病原菌進行檢測，因此病原微生物的檢測結(jié)果往往存在不同程度的滯后性。這不僅不利于食品安全管理體系及時驗證控制措施實施效果，而且不利于對潛在不安全產(chǎn)品迅速采取糾正和糾正措施。對食源性致病菌進行準(zhǔn)確、靈敏、省時、省力和省成本的快速檢驗方法已經(jīng)成為保證食品安全的迫切需求。

1.1 分子生物學(xué)技術(shù)

1.1.1 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）

PCR的基本原理是在體外對特定的雙鏈DNA片斷進行高效擴增，故又稱基因體外擴增法。通過體外酶促反應(yīng)合成特異性DNA片段，再通過擴增產(chǎn)物來識別細菌。由于PCR靈敏度高，理論上可以檢出一個細菌的拷貝基因，因此在細菌的檢測中只需短時間增菌甚至不增菌，即可通過PCR進行篩選，節(jié)約了大量時間。但PCR技術(shù)也存在一些缺點：食物成分、增菌培養(yǎng)基成分和其他微生物DNA對Taq酶具有抑制作用，可能導(dǎo)致檢驗結(jié)果假陰性；操作過程要求嚴格，微量的外源性DNA進入PCR后可以引起無限放大產(chǎn)生假陽性結(jié)果；擴增過程中有一定的裝配誤差，會對結(jié)果產(chǎn)生影響。美國快力康公司推出了全球第一臺PCR全自動檢測儀BAX系統(tǒng)，克服了手工操作PCR的缺點，能用于檢測細菌，敏感性和特異性都非常好。

1.1.2基因探針技術(shù)

DNA探針是利用同位素、生物素等標(biāo)記的特定DNA片斷。DNA探針技術(shù)又稱分子雜交技術(shù)，是利用DNA分子的變性、復(fù)性以及堿基互補配對的高度精確性，采用高度特異性基因片段制備基因探針來識別細菌的新技術(shù)。法國生物一梅里埃公司的GEN?PROBE基因探針檢測系統(tǒng)，能夠在30分鐘內(nèi)完成對于分離到的單個菌落的確證試驗[1]。目前，DNA探針技術(shù)已經(jīng)在沙門氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌及乙型肝炎病毒等檢測中得到了應(yīng)用。基因探針的優(yōu)點是減少了基因片段長度多態(tài)性所需要分析的條帶數(shù)，但是缺點是不能鑒定目標(biāo)菌以外的其他菌。

1.1.3 基因芯片技術(shù)

基因芯片是采用微加工和微電子技術(shù)將各種基因寡核苷酸有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體上而得到的一種信息檢測芯片。微生物樣品DNA經(jīng)PCR擴增后制備熒光標(biāo)記探針，然后再與芯片上寡核苷酸點雜交，通過掃描儀定量分析熒光分布模式從而來確定檢測樣品是否存在某些特定微生物。理論上，基因芯片可以在一次實驗中檢出所有潛在的致病原，也可以用同一張芯片檢測某一致病原的各種遺傳學(xué)指標(biāo)，具有簡便快速、特異性強、靈敏度高、可并行檢測等優(yōu)點，因而在食品檢測領(lǐng)域有著廣泛的發(fā)展前景。李君文[2]等建立了以基因芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的水中常見致病菌的快速檢測與鑒定技術(shù)，其檢測水中常見致病菌的敏感性可達5．6×10 個／mL細菌菌落的核酸。Carl等[3]對大腸埃希菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌和空腸彎曲菌采用了基因芯片的檢測方法，其檢測結(jié)果不僅敏感度高于傳統(tǒng)方法，而且操作簡單，重復(fù)性好，并且節(jié)省了大量時間，大大提高了4種細菌診斷效率。Volokhov[4]通過單管復(fù)合體PCR擴增和基因芯片技術(shù)成功地檢測和鑒別了6種李斯特菌。Call等[5]通過分析E．coli O ：H 的Shiga樣毒素I,Shiga樣毒素Ⅱ及溶血素A，發(fā)現(xiàn)基因芯片可準(zhǔn)確檢測各種E．coli O157：H7分離物。

然而，基因芯片技術(shù)剛剛發(fā)展起來，許多地方還有待改進，如檢測成本高昂；檢測特異性有待提高；樣品制備過程應(yīng)該進一步簡化以及建立標(biāo)準(zhǔn)化程序等。

免疫學(xué)技術(shù)通過抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，再輔以免疫放大技術(shù)來鑒別細菌。免疫法有較高靈敏度，樣品在進行選擇性增菌后，抗原和抗體的結(jié)合反應(yīng)可在很短時間內(nèi)完成達到檢出度，不需分離，即可采用免疫技術(shù)進行篩選。

1.2.1 乳膠凝集反應(yīng)

乳膠凝集反應(yīng)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特性，加上人工大分子的乳膠顆粒而發(fā)生肉眼可見的凝集反應(yīng)。Aureus Test用于食品樣品中金黃色葡萄球菌的檢測，該試劑盒中含有對免疫抗蛋白A Ig G和鞭毛蛋白敏感的聚苯乙烯乳膠粒子，因細菌蛋白A和Ig G結(jié)合，凝聚酶和鞭毛抗原結(jié)合，所以當(dāng)含有金黃色葡萄球菌的樣品懸浮液加入含乳膠粒子的試劑盒中時1分鐘內(nèi)將產(chǎn)生凝集反應(yīng)。該法的靈敏度和特異性均較高。

1.2.2 酶聯(lián)免疫法（ELISA）

ELISA是把抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機地結(jié)合起來的一種檢測技術(shù)，它既可測抗原，也可測抗體。ELISA法可用于檢測食品中李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157、彎曲桿菌、假單胞菌屬、致賀氏菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌等。趙志晶等[6]建立了適宜食品樣品中大腸桿菌O157：H7，檢測的雙抗ELISA方法，經(jīng)過增菌，雞肉與牛奶染菌樣品中的檢出限為0.1CFU／g(CFU/mL)。Cryan等[7]在研究大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli．)內(nèi)毒素時，將ELISA法與DNA探針技術(shù)等進行比較，發(fā)現(xiàn)ELISA技術(shù)更靈敏、快速。此外，ELISA法還可用于食品介導(dǎo)的病毒的檢測，目前我國已完成了禽流感流行株的分離和鑒定、禽流感重組核蛋白診斷抗原的研制及應(yīng)用，建立了禽流感免疫酶診斷方法和技術(shù)，已具備試劑盒生產(chǎn)能力。

1.2.3 免疫磁性分離法

免疫磁性分離方法，是將特異性抗體偶聯(lián)在磁性顆粒表面，與樣品中被檢致病微生物發(fā)生特異性結(jié)合，載有致病微生物的磁性顆粒在外加磁場的作用下，向磁極方向聚集，通過棄去檢樣混合液，使致病微生物不但得到分離，而且也得到濃集的方法。由于食品檢樣常為固液多相混合體，采用常規(guī)方法難以將少量的致病微生物分離出來。免疫磁性分離技術(shù)以其特有的性能，在食品衛(wèi)生檢測和研究中取得了較好的結(jié)果。Skjelse等[8]報道了用免疫磁性分離技術(shù)從乳及乳制品、肉類和蔬菜中分離出沙門氏菌，其檢測限為10-20個/g。Chapman等[9]報道了在英國由牛奶引起的大腸桿菌O157:H7感染，可疑食物通過微生物學(xué)方法得到證實，但檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確快捷主要緣于免疫磁性分離技術(shù)的成功應(yīng)用。Skjerve等[10]用抗李斯特菌鞭毛抗原的單克隆抗體包被磁性微球，捕獲增菌食物中的單核細胞增生性李斯特菌。采用免疫磁珠法可有效地收集、濃縮副溶血性弧菌，可顯著提高環(huán)境樣品及食品中病原性副溶血性弧菌的檢出率[11] 。

1.2.4 微型自動熒光酶標(biāo)分析法(mini VIDAS)

mini VIDAS是利用酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)，通過抗原-抗體特異反應(yīng)，分離出目標(biāo)菌，由特殊儀器根據(jù)熒光的強弱自動判斷樣品的陽性或陰性。VIDAS法檢測食品沙門菌較常規(guī)法敏感特異，用其檢測為陰性的樣品能很快作出非沙門菌的判斷，比常規(guī)法可提前2～3天。VIDAS法用于進出口凍肉的檢測，可大大縮短檢驗時間，加快通關(guān)速度[12]，檢測凍肉中李斯特氏菌亦如此[13]。

1.3.1 ATP生物發(fā)光法

ATP生物發(fā)光法是近年發(fā)展較快的一種用于食品生產(chǎn)加工設(shè)備潔凈度檢測的快速檢測方法。利用ATP生物發(fā)光分析技術(shù)和體細胞清除技術(shù)測量細菌ATP和體細胞ATP，推算出樣品中的含菌量。由于生物發(fā)光法無需培養(yǎng)過程，操作簡便、靈敏度高，因此在短時間內(nèi)即可得到檢測結(jié)果，具有其它微生物檢測方法無可比擬的優(yōu)勢。ATP 生物發(fā)光分析技術(shù)已經(jīng)用于肉類食品細菌污染狀況及食品器具的現(xiàn)場衛(wèi)生學(xué)檢測[14][15]。

1.3.2 電阻抗技術(shù)

電阻抗法的原理是細菌在生長繁殖中，將培養(yǎng)基中的碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類等大分子電惰性物質(zhì)，代謝為具有電活性的乳酸鹽、醋酸鹽等小分子物質(zhì)，使培養(yǎng)基的阻抗發(fā)生變化，通過檢測培養(yǎng)基的電阻抗變化情況，判定細菌在培養(yǎng)基中的生長繁殖特性，檢測出相應(yīng)的細菌。該法具有檢測速度快、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點，目前已經(jīng)用于細菌總數(shù)、霉菌、酵母菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等的檢測。。Martins 和Selby 用直接阻抗法精確測定了污染肉制品中大腸菌的含量。Quinn等[16]分別用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)與3種快速檢測方法(阻抗法、基因探針法和沙門氏菌示蹤法)對禽類飼料和環(huán)境樣品中的沙門氏菌進行檢測，阻抗法是幾種方法中最少受到主觀因素干擾的。Pless等[17]分別用阻抗法和傳統(tǒng)檢測方法進行對照試驗，對250種食品樣品進行了檢測。在122種沙門氏菌陽性樣品中，用阻抗方法檢出的有119種，傳統(tǒng)的亞硒酸鹽一胱氨酸培養(yǎng)基檢出106種，用RV培養(yǎng)基僅檢出92種。

1.3.3 其他的代謝技術(shù)

放射測量技術(shù)是利用細菌在生長繁殖過程中代謝碳水化合物而產(chǎn)生CO2的原理，把微量的放射性14C標(biāo)記引入碳水化合物分子中，通過測定14CO2 的含量，從而判斷細菌的數(shù)量。目前，該法已用于測定食品中的細菌，具有快速、準(zhǔn)確度高和自動化等優(yōu)點[18]。

微熱量技術(shù)是通過測定細菌生長時熱量的變化進行細菌的檢出和鑒別。通過建立與絕對微生物細胞數(shù)相關(guān)的溫譜圖，可以用微熱量對微生物進行計數(shù)。

接觸酶測定技術(shù)是通過計算一個含有接觸酶的紙盤在盛有H202的試管中的漂浮時間來估計菌數(shù)。當(dāng)樣品接觸酶陽性細菌含量越高，接觸酶與H202反應(yīng)放出氧氣越多，紙盤上浮的時間越短。大多數(shù)腐敗微生物是嗜冷性細菌，而大多數(shù)嗜冷細菌接觸酶呈陽性，故可以用接觸酶反應(yīng)來估計食品中的嗜冷性菌群。

1.4.1 紙片法

目前已經(jīng)有許多微生物檢測紙片，可分別檢測菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌、沙門菌、葡萄球菌等，這些紙片快速檢測與傳統(tǒng)檢測方法之間的相關(guān)性非常好。如用大腸菌群快檢紙片檢測餐具的表面，操作簡便、快速、省料，特異性和敏感性與發(fā)酵法符合率高，已經(jīng)被列為國標(biāo)方法。美國3M公司生產(chǎn)的PF (Petrilm)試紙還加入了染色劑、顯色劑，增強了效果，而且避免了熱瓊脂法不適宜受損細菌恢復(fù)的缺陷。在大腸菌群檢測方面，國際方法報告的是MPN值而不是每克食品中的大腸菌群數(shù)，PF法則可以得出精確數(shù)據(jù)[19]。霉菌快速檢測紙片操作簡便，不需要低溫設(shè)備，僅需36℃培養(yǎng)48小時就可觀察結(jié)果，比國標(biāo)法縮短3～5天，在霉菌檢出率上無顯著性差異，且菌落典型，易判定,大大提高了工作效率。利用細菌產(chǎn)生某些代謝酶或代謝產(chǎn)物的特點而建立的紙片熒光法已經(jīng)用于檢測食品中大腸菌群、大腸桿菌，通過檢測365nm紫外光下的熒光產(chǎn)物，判斷有關(guān)酶的活性，從而達到檢測的目的。紙片可高壓滅菌處理，4℃保存，簡化了實驗準(zhǔn)備、操作和判斷。

1.4.2 細菌直接計數(shù)法

細菌直接計數(shù)法主要包括流式細胞儀(FCM)和固相細胞計數(shù)(SPC)法。FCM通常以激光作為發(fā)光源，經(jīng)過聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。光散射信號基本上反映了細胞體積的大��；熒光信號的強度則代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內(nèi)物質(zhì)的濃度，由此可通過儀器檢測散射光信號和熒光信號來估計微生物的大小、形狀和數(shù)量。流式細胞計數(shù)具有高度的敏感性，可同時對目的菌進行定性和定量分析。目前已經(jīng)建立了細菌總數(shù)[20]、致病性沙門菌、大腸埃希氏菌[21]等的FCM檢驗方法。MClelland RD和Dinder AC用該儀器結(jié)合單克隆抗體檢測食品中的沙門氏菌，靈敏度達到0.1CFU/g。SPC可以在單個細胞水平對細菌進行快速檢測[22]。濾過樣品后，存留的微生物在濾膜上進行熒光標(biāo)記，采用激光掃描設(shè)備自動計數(shù)。對于生長緩慢的微生物，檢測用時短使該方法明顯優(yōu)于傳統(tǒng)平板計數(shù)法。

1.4.3 噬菌體鑒定技術(shù)

噬菌體是一種寄生于細菌的病毒，細菌基本上都有自己的噬菌體，而且具有專一的寄生性，以及生長速度快等特點，常被用來鑒定一些特定的致病菌，其中以鑒定腸桿菌科細菌和金黃色葡萄球菌最具成效。史玲等利用腸桿菌科噬菌體進行食品和餐具細菌檢測，對沙門氏菌和志賀氏菌的檢測僅需24-30小時。

1.4.4 全自動微生物分析系統(tǒng)(AMS)

Vitek?AMS自動微生物檢測系統(tǒng)是一種由傳統(tǒng)生化反應(yīng)及微生物檢測技術(shù)與現(xiàn)代計算機技術(shù)相結(jié)合，運用概率最大近似值模型法進行自動微生物檢測的技術(shù)。AMS以每種細菌的微量生化反應(yīng)為基礎(chǔ)，無須經(jīng)過微生物分離培養(yǎng)和純化過程，就能直接從樣品檢出特殊的微生物種類和菌群來，可鑒定405種細菌[23]。AMS能同時進行60-200個樣品的分析，速度快、易操作、結(jié)果準(zhǔn)確。用AMS鑒定沙門菌屬只需4小時，鑒定志賀氏菌屬只需6小時，鑒定霍亂弧菌等致病性弧菌亦只需4-13小時[24]。

微生物快速檢測技術(shù)都各自表現(xiàn)出很多優(yōu)點，但也還存在著不足。由于被污染食品中微生物種群繁多，成分復(fù)雜，各種食品中都可能存在阻礙檢測準(zhǔn)確性的抑制因素，另外，受污染食品中的同屬相似菌，操作過程中的微小誤差都會嚴重干擾檢測結(jié)果。目前，多數(shù)快速檢測方法還僅僅作為篩選方法使用，在實踐中起到參考作用。不斷完善和改進現(xiàn)有的快速檢測技術(shù)，建立更靈敏、更有效、更可靠、更簡便的檢測技術(shù)，是食品病原微生物快速檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢。

2.1 充分發(fā)揮不同快速檢測技術(shù)優(yōu)勢

目前采用的快速檢測方法還有許多需要完善的地方，如快速往往伴隨準(zhǔn)確性的降低，如普遍使用的酶聯(lián)免疫法還有假陽性的問題存在。在實踐中使用快速檢測技術(shù)，必須熟悉各種快速方法的優(yōu)缺點，盡量選擇標(biāo)準(zhǔn)中推薦的快速方法或權(quán)威機構(gòu)認可的快速方法，在不同的應(yīng)用中發(fā)揮快速檢測技術(shù)的優(yōu)勢。

2.2 提高檢測產(chǎn)品質(zhì)量，使檢測更準(zhǔn)確

快速檢測技術(shù)的特異性、靈敏度很高，相關(guān)試劑的質(zhì)量對檢測結(jié)果的影響很大。應(yīng)采用新的工藝，提高實驗相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量，優(yōu)化設(shè)計特殊培養(yǎng)基，對于檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性具有十分重要的意義。

2.3 實現(xiàn)快速檢測標(biāo)準(zhǔn)化、國產(chǎn)化

目前我國采用的大多數(shù)是國外的快速檢測技術(shù)，檢測成本高，缺乏相應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)。在以后的工作中，應(yīng)采取多種方法，引進、消化國外的先進技術(shù)，生產(chǎn)出我國自己的快速檢測產(chǎn)品。同時積極組織研究所、大專院校和企業(yè)的專家建立國家標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，推動我國快速檢測技術(shù)的發(fā)展。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人們對食品安全的重視程度的不斷增強，食品中病原微生物的快速檢測將在食品工業(yè)原料質(zhì)量估測、加工工藝評估、成品質(zhì)量檢測、產(chǎn)品貨架期預(yù)測等方面得到越來越廣泛的應(yīng)用，在食品安全管理體系的建立和實施中發(fā)揮越來越重要的作用。這些快速檢測技術(shù)的推廣應(yīng)用，不僅是對傳統(tǒng)的食品安全檢測技術(shù)的一個改進和提高，也使我們的食品質(zhì)量安全有了進一步的保證，從而推動食品工業(yè)更加健康、快速向前發(fā)展，改變?nèi)祟惖纳�活質(zhì)量，滿足人民提高健康水平的需要。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進步，相信會有更多快速、簡便、特異的檢測技術(shù)得到應(yīng)用，以滿足人們對食品安全的更高需求。

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