上海出入境檢驗檢疫局  張 柳    韓 偉

 

 

摘 要 近年來我國出口至日本的熱加工禽肉、偶蹄類產品多次被日本農林水產省查出加熱不充分，相關企業被令出口暫停，而判定依據是對出口樣品實施的可溶性蛋白SDS-PAGE電泳圖譜比對結果。我國對輸日相關產品尚未推廣利用變性蛋白電泳檢測法來推斷產品的受加熱程度，技術層面的落后使我們在中日貿易雙方談判中處于被動狀態。本文從背景、意義、檢測原理、操作方案等角度研究了全自動蛋白芯片檢測法做為熱加工肉及含肉食品HACCP實施中的加熱效果驗證措施的可行性和展望前景。

 

關鍵詞 熱加工肉及含肉食品   技術壁壘    HACCP     蛋白變性      全自動蛋白芯片檢測  

 

肉及含肉制品加工企業通常以殺滅特定致病性微生物為目的，通過蒸、煮、油炸或其他方式將經處理后的肉及含肉制品加熱，并達到無致病性微生物和相關法規的安全衛生要求。正是由于熱加工是一種非常有效的生物危害控制措施，因而得到了大多數生產企業的關鍵性重視---被確立為加工中的關鍵控制點。那么如何對此關鍵工序的執行效果進行驗證呢？綜合來講，加熱過程中對監控人員的監控行為直接進行觀察、審核加熱過程記錄、對加熱設備及其關鍵參數顯示、記錄設施進行校準、對加熱工藝進行確認、對加熱后產品做微生物檢測等方法都是可行且必須的熱加工效果驗證措施。但是，近年來我國出口至日本的熱加工禽肉、偶蹄類產品多次被日本農林水產省檢測出加熱不充分，相關企業被令出口暫停的事件，使我國對日出口熱加工偶蹄類、禽肉類產品再次面臨著嚴峻的技術貿易壁壘形勢。當日方檢測部門出具加熱不充分樣品中變性蛋白電泳分析檢測結果時，我們無法質疑且只能全盤接受，因為我們的檢測技術滯后了！因此，研究和建立一個直接、精確的檢測熱加工肉及肉制品加熱程度的方法，不但可以改變當前我們在此項檢測方面的不利處境，從而在應對貿易壁壘中不再無語和啞然，更可以為我國進口食品筑起一道技術高墻。

攻守兩易的技術貿易壁壘政策，讓我們開始了對基于蛋白質變性的分子生物學原理而建立的凝膠電泳法的關注。

 

熱加工肉及含肉制品加熱效果驗證的傳統方法與新方法

很多研究表明，加熱過程中肌肉的變化與加熱終點溫度之間存在聯系，如肌肉顏色、組織結構和蛋白質性質、酶活性的變化等。根據這些變化，已有多種驗證加熱效果的產品檢測方法被開發和建立起來。

常規的產品加熱效果驗證方法主要是感官檢測，即顏色、組織形態的判別法。動物肌肉的肌紅蛋白加熱到65℃-80℃時會變性，使肌肉顏色傾向棕色，目測及可見分光光度計均可進行判斷；而加熱引起的肌肉組織的結構變化如肌纖維的收縮崩解等也可通過目測判斷。另外，骨髓凝固、血水消失等常識也被用于判定產品是否被充分加熱的感官指標。感官檢測具有簡便易行，快速直觀的特點，但其結果對經驗依賴性較大，一般難于量化，準確性有波動；另外，結果隨感官檢驗施行人員不同而存在較為顯著的個體判斷差別。

天然蛋白質的嚴密結構在某些物理或化學因素作用下，其特定的空間結構被破壞，從而導致理化性質改變和生物學活性的喪失，稱為變性(denaturation)。動物肌肉富含蛋白質，加熱主要是破壞蛋白質分子中的氫鍵，導致其溶解度降低，粘度增加，結晶性破壞，酶活性發生變化。根據加熱過程中蛋白質的這些變化特點，通過檢測不同加熱程度的熱變性蛋白分子量便可對加熱終點溫度得出間接推斷。相關的方法有可溶性蛋白的SDS-PAGE電泳、Western-Blot法、蛋白凝聚試驗、特定的酶活性測定以及對指示蛋白的免疫學檢測等。綜合方法的簡便性、重復性和穩定性，蛋白質的凝膠電泳分析不失為一種有效的驗證肉類加熱程度的方法。而隨著新方法的完善，半自動與全自動的檢測儀器也有了較高的商業化程度，如微流芯片分離電泳的新產品ExperionTM全自動電泳系統結合相應的蛋白芯片, 可在30分鐘內快速全自動完成整個蛋白電泳及條帶分析。將其應用于加熱變性蛋白的檢測，可迅速有效地判斷加熱終點溫度是否達到加工工藝和相關法規的要求，從而為HACCP實施提供了科學、便捷的有效性驗證方法，尤其適合作為官方驗證的一種舉措。

 

全自動蛋白芯片檢測與監測加熱程度的方法的具體步驟與結果

[材料]

樣品制備用儀器與試劑

PBS(0.01mol/L)；天平；Bagmixer擊拍器及Bagpage樣品袋；刻度吸管；低溫離心機；離心管；記號筆；中心溫度計等

Experion™ 系統 自動電泳工作站和制膠工作站

試劑盒，包括微流芯片和用于蛋白質分析的試劑，可分辯并定量從10到260 kD大小的蛋白質樣本

電腦配置：Pentium 4，2GHz，512 K RAM，Windows 2K或XP，多重USB接口

樣品來源

熱加工含偶蹄類肉、禽肉類食品，包括不同加熱方式、不同加熱階段的半成品與成品樣品

[方法步驟]

樣本制備

將待檢的不同加熱程度食品樣品剪成大約10g左右，放入Bagpage樣品袋中，添加90mL PBS；

用Bagmixer擊拍器擊拍10min后靜置0.5hr；

取上清液，8000rpm低溫離心20min；

取離心上清液1mL，加入微量離心管，每管1mL，做標記；

再在8，000rpm低溫離心 5min，備用。

2、芯片的制膠和加樣

1）使用前，所有試劑盒中的試劑達到室溫平衡，并輕輕振蕩混勻；

2）按蛋白質分析試劑盒的使用手冊要求制膠和制樣。

3）將樣本和分子量標記加入到芯片中，緩慢的加入芯片試劑，避免引入氣泡。

3、運行分析

1）點擊電腦桌面上的Experion圖標，運行軟件；

2）將制膠并加樣的芯片應立即或在5分鐘內放入自動電泳工作站中的芯片平臺上，固定妥當，合上蓋子；

3）按操作界面要求運行分析，波峰/電泳圖譜和膠視圖均可顯示，以監測運行的進展結果。

[結 果]

不同加熱情況的偶蹄類肉、禽肉食品的蛋白質變性情況

1）蒸汽加熱

樣品1：蒸制雞腿肉串（蒸前45G）

加熱方式與CCP要求：肉串進入蒸箱內，100℃蒸汽蒸12分鐘，肉中心溫度達到70℃以上并保持1分鐘以上。

 

樣品2： 35克小肉包（豬肉）

加熱方式與CCP要求：肉包進入蒸箱，100℃蒸汽蒸制10分鐘，肉中心溫度達到70℃以上并保持1分鐘以上。

 

2）油炸加熱

樣品：裹漿油炸雞腿肉塊

加熱方式與CCP要求：第一次油炸（棕櫚油）160℃80秒；經過10秒輸送帶后，進行第二次油炸，165℃135秒；肉中心溫度為70℃以上并維持1分鐘以上。

 

3）烤制加熱

樣品：烤牛舌片

加熱方式：電烤720度3分鐘。

 

[討 論]

Experion™ 全自動蛋白芯片檢測系統是一種基于熒光電泳的蛋白質測定方法。將其應用于禽、肉制品中加熱變性蛋白的檢測具有快速、簡單、高效等特點，且能保證試驗的重復性與穩定性。

從對不同加熱方法和加熱程度的偶蹄類肉、禽類食品的蛋白質變性情況的檢測結果來看，加熱方式對變性蛋白電泳圖譜的影響不大，產品在加熱過程中曾經達到的最高中心溫度以及相應的維持時間是影響蛋白圖譜條帶的主要因素。隨加工溫度的增高，維持時間的增加 ，蛋白質的大分子量條帶趨于消失，而在小分子量區域的條帶不但不變，有時甚至有增多現象，這就提示了加熱過程可使大分子可溶蛋白變性而減少。反言之，根據蛋白電泳圖譜可提示肉、禽產品是否經過適當有效的加熱處理，驗證加熱效果。

 

全自動蛋白芯片檢測法做為熱加工肉及含肉制品HACCP體系驗證措施的前景和展望

上述討論結果給我們帶來了通過全自動蛋白芯片檢測法來驗證熱加工肉類產品是否達到法規要求的加熱程度的全新視點。我們可以這樣做：將成品樣品分成兩份，一份直接按照上述方法步驟進行檢測，得出圖譜（如下圖3）；將另一份進行水浴或蒸等加熱處理，但在這過程中須嚴格控制樣品的加熱程度不能超出法規臨界要求，比如按日本農林水產省相關要求，使樣品在中心溫度達到70度開始維持并計時1分鐘后中止加熱，然后做電泳檢測并得出另一張圖譜（如下圖4）。根據蛋白加熱變性的不可逆性，加熱充分的成品樣品即使經過再次加熱，其圖譜的前后變化也不大，而加熱不充分的成品樣品經過再次加熱后蛋白圖譜會有較大的差異。通過兩個圖譜的對比判斷，可判斷樣品所代表的成品是否達到了法規基本加熱要求。但值得注意的是，樣品按法規要求進行熱處理時務必“見好就收”，即控制好中心溫度和維持時間，以免得到超出實際法規加熱限值的圖譜而做出誤判。

 

讓我們把目光再次投向近年來的多起輸日熱加工禽肉、偶蹄類肉產品的加熱不充分事件：日本農林水產省對從中國大陸進口熱加工含偶蹄類肉、禽肉類產品的動物衛生要求中明確規定了幾種不同加熱方式的加熱要求，并據此開展貿易產品的驗證性檢測，“加熱不充分”事件的判定也就是基于樣品熱處理前后的蛋白電泳圖譜比對；不過據了解，他們尚未采取全自動蛋白芯片檢測，因而試驗結果的重復性和穩定性較差，況且法規加熱限值圖譜是否存在偏差也不得而知。相信如果我們在對日出口熱加工禽肉、偶蹄類肉產品貿易中開展了一定規模的變性蛋白電泳檢測來驗證產品的加熱效果，我們就會有足夠的底氣和數據與日本農林水產省等部門平等對話和交流，只有建立了蛋白變性圖譜與不同加熱程度的數據基礎平臺，才可以防止日本有關部門隨意將穩定性、重復性有待質疑的蛋白質電泳檢測結果作為判斷產品是否滿足其法規要求的單方面行為，同時也可以為我國進口同類產品設立科學、易行的技術壁壘手段。

因此，我們滿懷信心：將全自動蛋白芯片檢測驗證產品法運用于熱加工含肉食品HACCP實施中的產品加熱效果驗證勢在必行，且有著非常實用的前景！

 

 

參 考 文 獻

1. Experion™ 系統使用手冊，伯樂生命科學有限公司

2. JIS 3837-1995, SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分析通則

3. 劉恒等，生豬肉與加熱豬肉SDS-PAGE電泳檢測方法的研究，口岸衛生控制，第9卷第1期，14-15

4. 賀艷等，肉類加熱重點溫度檢測方法的研究進展，Food&Machiney,2004(4),22-24

 

2007年6月